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SYBRGreenI荧光定量PCR
会计学1
主要内容
■第一部分：PCR简介
口第二部分：RNA的提取
□第三部分：RT
口第四部分：实时荧光定量PCR
口第五部分：数据分析
口第六部分：误差校正
口第七部分：常见问题分析
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第一部分：PCR简介
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PCR技术的发明
1985年教
授发明了具有划时代意义的
PCR技术。
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PCRPolymeraseChainReaction
※PCR(聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩
增特定DNA片段的方法。
必是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、
引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。
必运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的
DNA片段，使皮克(Pg,10-12)起始物达到
微克(μg,10-6)水平。
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2.PCR原理
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PCR类型
□RT-PCR·重组PCR
●荧光定量PCR
□兼并引物●锚定PCR
PCR·多重PCR
□巢式PCR·定量PCR
□反向PCR
□不对称PCR
□原位PCR第6页/共65页
实时荧光定量PCR技术
real-timefluorescentquantitativePCR
FQ-PCR
□是一种在PCR反应体系中加入荧
光基团，利用荧光信号积累实
时监测整个PCR进程，最后通过
特定数学原理对未知模板进行
定量分析的方法，实现了PCR从
定性到定量的飞跃。
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实时荧光定量PCR技术分类
□荧光探针
Beacon法：以美国人Tagyi为
代表
TaqMan探针：以美国ABI公司
为代表
FRET技术：以罗氏公司为代表
荧光染料
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饱和荧光染料：EvaGreen、LC
Green
荧光染料嵌合法(SYBRGreenI)
SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺
旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
SYBRGreenI
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荧光染料嵌合法(SYBRGreenI)作用机理示意图
热变性引物荧光物质
引物退火DNA聚合酶FF
F
一F
延伸反应
F,F,;FF,
F1L
第10页/共65页TaKaRa
□第二部分：RNA的提取
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提RNA基本步骤
标本
Trizol
氯仿
异丙醇
75%乙醇
l
DEPC水溶解
RNA的抽提注意事项
□所有用具去RNase处理
□戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污
染
□尽量快速
□4℃离
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