《离心分离技术》课件.pptVIP

*************************************第六章：差速离心技术低速离心沉淀大颗粒组分（如细胞、核）中速离心分离中等颗粒（如线粒体、溶酶体）高速离心收集小颗粒组分（如微粒体、膜组分）超速离心沉淀最小颗粒（如核糖体、病毒等）差速离心是一种按照颗粒沉降速度差异进行分离的技术，主要基于颗粒大小和密度的不同。通过逐步增加离心力或延长离心时间，依次沉淀不同大小的颗粒，实现复杂混合物的分级分离。这种技术操作相对简单，不需要特殊的梯度介质，是分离细胞器和生物大分子的经典方法。本章将系统介绍差速离心的基本原理、应用范围、操作步骤和优化策略。我们将学习如何根据样品特性设计差速离心方案，选择合适的离心条件，实现高效分离。差速离心虽然分辨率不如密度梯度离心，但因其简便快捷的特点，在细胞分析、亚细胞组分制备和初步纯化等领域具有广泛应用。6.1差速离心原理沉降速度差异基于粒径和密度差异的分离渐进离心力从低到高逐步增加离心力分步收集依次收集不同大小的颗粒差速离心的核心原理是颗粒大小与沉降速度的关系。根据斯托克斯定律，在相同离心条件下，颗粒的沉降速度与其直径的平方成正比。例如，直径为10μm的颗粒沉降速度约为直径5μm颗粒的4倍。因此，通过控制离心力和时间，可以使某一粒径范围的颗粒沉淀，而更小的颗粒仍保持悬浮状态。实际操作中，差速离心通常采用分步离心策略：先使用较低的离心力（如500-1,000×g）短时间离心，沉淀最大颗粒（如细胞、细胞核）；收集上清液后增加离心力（如10,000-15,000×g），沉淀中等大小颗粒（如线粒体、溶酶体）；进一步增加离心力（如100,000×g），沉淀微小颗粒（如微粒体、膜泡）；最后使用最高离心力（如150,000-300,000×g）沉淀极小颗粒（如核糖体、大分子复合物）。这一系列步骤能够将混合物中的不同组分逐一分离。6.2差速离心的应用差速离心在细胞器分离领域有广泛应用。典型的哺乳动物细胞亚细胞组分分离流程包括：组织匀浆后先以600-1,000×g离心10分钟沉淀未破碎的细胞和细胞核；上清液以10,000-15,000×g离心15分钟沉淀线粒体；进一步以20,000×g离心20分钟分离溶酶体和过氧化物酶体；最后以100,000×g离心60分钟收集微粒体和内质网碎片。这种分级分离为细胞器功能和结构研究提供了重要工具。在病毒纯化领域，差速离心同样发挥重要作用。病毒培养物通常先经低速离心(5,000-10,000×g)去除细胞碎片，然后通过超速离心(80,000-150,000×g，2-4小时)浓缩病毒颗粒。这种方法用于包括流感病毒、腺病毒、冠状病毒等多种病毒的纯化和浓缩，是疫苗制备和病毒研究的基础技术。现代差速离心经常与其他技术如密度梯度离心结合使用，先通过差速离心进行初步分离，再用密度梯度离心实现更精细的纯化。6.3离心条件优化转速选择转速选择是差速离心优化的首要因素。转速过低，目标颗粒沉淀不完全；转速过高，可能导致非目标颗粒共沉淀。对于未知样品，建议先参考文献中类似样品的条件，再进行小规模测试调整。对于细胞器分离，经典转速范围通常为：细胞核600-1,000×g，线粒体8,000-12,000×g，溶酶体15,000-20,000×g，微粒体100,000×g，核糖体150,000×g以上。时间调整离心时间与转速相互关联，需要综合考虑。转速较低时可适当延长时间，反之亦然。时间过短会导致收率降低，时间过长则可能引起样品降解或混合物过度压实。优化时可采用时间梯度实验，在固定转速下尝试不同离心时间（如10、20、30分钟），通过测量上清液和沉淀中目标物的含量确定最佳时间点。温度控制温度对差速离心影响显著。低温（通常4°C）有助于减缓酶促降解和维持样品稳定性，特别是对蛋白质和细胞器至关重要。然而，低温会增加溶液粘度，减慢沉降速度。某些特殊样品如脂质体可能在低温下发生相变，需要在特定温度操作。因此，温度选择需根据样品性质和分离目标综合考虑。缓冲液组成也是优化差速离心的重要因素。pH值应与目标组分的稳定性匹配；离子强度影响颗粒表面电荷和聚集状态；某些离子（如Ca2?、Mg2?）可能影响细胞器结构。常用缓冲体系包括：细胞器分离用的蔗糖-HEPES缓冲液、核酸分离用的Tris-EDTA缓冲液等。此外，可根据需要添加保护剂（如抗氧化剂、酶抑制剂）或稳定剂（如甘油、白蛋白）以提高样品稳定性和离心效果。6.4收集与纯化沉淀处理沉淀收集是差速离心后的关键步骤。收集前应小心倒出或吸出上清液，避免扰动沉淀。对于贵重样品，可留少量上清液后再收集沉淀，确保最高回收率。收集的沉