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第8章梯度洗脱

8-1引言

如前所述，等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变（例如50%甲醇-水），而在梯度洗

脱中流动相组成随运行过程是变化的（例如5→100%甲醇-水）。梯度洗脱中一般采用二元（溶

剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。图8-1所示为

几种不同类型的梯度变化，其中线性梯度最为常用。除另有说明，本书中均假设为线性梯度。

图8-1所示为流动相组成在20min内，B浓度由0增大为100%（线性梯度，5%/min）。

许多样品用梯度洗脱会分离更好，但许多实验室却对梯度洗脱的应用存在很大偏见。其

原因有如下几点：

1、有些实验室尚不具备梯度洗脱设备。

2、梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析。

3、某些HPLC检测器（如示差折光检测器）不能使用梯度洗脱。

4、每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。

5、不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异。

6、梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂。

7、某些色谱柱╱流动相的联合应用不适于梯度洗脱。

如权衡采用梯度洗脱对每一分离的优缺点，那么很多分离将只适于使用梯度洗脱。本章

中我们将说明梯度洗脱分离实际上与等度洗脱非常相似，因此梯度洗脱的方法建立和日常操

作与等度洗脱相比并不太难。在8-5节中我们将探讨上述列举的梯度洗脱中存在的问题，以

及如何避免或减少这些问题的方法。

100100

线性梯度曲线梯度

%B5050

0102001020

100

分段梯度

%B50

01020

图8-1不同的梯度形状

下面的讨论主要针对反相条件，但是其它HPLC模式的梯度洗脱也遵循相同的原理。

我们以目前对梯度洗脱详尽而全面的理解，可以通过几次初始实验的分离情况对以后分离进

行准确地预测（见10-2-2节）。

8-2梯度洗脱的应用

1、具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5k20）。

2、大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品，见第11章）。

3、样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。

4、溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。

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此外，即使最终有可能使用等度方法，初始实验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立

的最佳起点。

8-2-1梯度洗脱用于常规分析

8-2-1-1样品的保留值范围

选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。图8-2所示为二烷基邻苯二甲

酸酯混合物的分离，该同系混合物包括二甲基（1）、甲乙基（2）、二乙基（3）、二正戊基（9）

邻苯二甲酸酯，在C8柱上采用不同组成的乙腈-水流动相进行分离。50%B的等度分离可以

获得较好分离度[见图8-2a关键峰对1╱2的Rs=1.5，但运行时间较长（70min）]；而且，