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基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室李丰

研究某一目的基因功能一般策略目的DNA获得来自三条途径:1.????genome上的特定区域或序列2.??????含有目的DNA的质粒3.??????从cDNA文库中扩增单个已知cDNA获得目的DNA构建含目的DNA质粒转化细菌?蛋白表达纯化转染真核细胞?蛋白定位、表达及表型变化

第一部分PCR

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片断的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。010203聚合酶链反应（PCR）技术

一、PCR实验原理

一、PCR实验原理

rimer长度：18-30bp引物短?特异性降低引物长?影响产物生成01rimer浓度：0.1-1.0umol/L浓度过高?错配、引物二聚体增加浓度过低?PCR效率降低021.PCR引物二、PCR的反应体系

二、PCR的反应体系缓冲液KCl、Tris-Cl、MgCl2，Mg2+：1.5～2.0mMMg2+:DNA聚合酶活性PCR产量Mg2+:PCR反应特异性

1TaqDNA聚合酶LADNA聚合酶?2PrimeSTAR(PyrobestDNA聚合酶)3PfuDNA聚合酶3.DNA聚合酶二、PCR的反应体系

TaqDNApolymerase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘5’?3’DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的条件下，以dNTP作为底物，沿5’?3’方向合成与模板互补的DNA

logoLATaqDNAPolymerase5’?3’DNA聚合酶活性；3’?5’DNA外切酶活性。

PyrobestpfuDNAPolymeraseTaqDNA聚合酶活性3’?5’外切酶活性，可信度极高PCR产物为平滑末端

4．dNTP:50-200umol/L5.模板DNA链DNA链DNA度：基因组DNA：1ug质粒DNA：10ngPCR的反应体系

性(denature):95℃高温下,双螺旋氢键断1裂,双链DNA解链成为单链DNA2火(annealing):两条引物与模板DNA扩增区3域的两端按碱基互补配对结合.4伸(extension):在4种dNTP底物及Mg2+存在5条件下,TaqDNA聚合酶在72℃下,将单核6苷酸按碱基互补配对原则从引物3‘端掺7入,,使引物沿5’→3’方向延伸合成新股DNA8三、基本操作步骤

性:95℃变性20-30s,即可使各种DNA完全变性。火:引物与模板退火温度由引物长度和GC%决定,退火温度一般应比Tm值低4-12℃为宜,退火时间一般为20-40s。伸:通常68-75℃。延伸时间取决于扩增片断的长度.可以500bp/30s为基准，根据目的片断的长度计算反应时间。次数：一般为25-35次。四、条件优化

PCR反应液PCRBuffer（Mg2+）2.5μldNTP混合物（各2.5mM）4μl模板DNA1μl引物1（20uM）0.5μl引物2（20uM）0.5μlTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25μlddH2O至25μl

94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min4℃forever72℃10min010203040594℃5minPCR反应条件

PCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个目标上取得平衡.可以利用计算机软件进行引物设计,引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡,找出最佳引物.有时也需根据实验的具体要求进行适当调整.五、PCR引物的设计

引物长度01在16-30bp范围内,以18-24bp为最佳.02引物过短,产物特异性降低,每增加一个核苷酸,引物特异性可增加4倍.03引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分,不包括为后续克隆而加的酶切位点与