新型冠状病毒检测技术规范血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序.docxVIP

新型冠状病毒检测技术规范血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序.docx

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新型冠状病毒检测技术规范血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序

样品准备

1.血清标本采集:选用无菌真空管采集静脉血,凝固后,以3000rpm离心10分钟,分离血清。对于婴幼儿,若无法采集静脉血,可采集指血。血清标本应避免反复冻融,短期保存可置于2-8℃,长期保存需置于-20℃或以下。

2.标本处理:检测前将血清标本取出,恢复至室温(18-25℃)。若血清标本出现浑浊、溶血、脂血等情况,可能会影响检测结果,应先进行适当处理。对于乳糜血标本,可采用高速离心或过滤等方法处理;对于溶血标本,可考虑重新采集标本或采用合适的检测试剂进行检测。

3.阴性、阳性对照及样品的加样:分别用移液器吸取阴性对照、阳性对照及待检样品各100μl,加入相应的酶标板孔中,注意每更换一种标本应更换移液器吸头,避免交叉污染。加样时应避免液体溅出孔外,确保加样量准确。

试剂准备

1.从冷藏环境中取出试剂盒,平衡至室温(18-25℃),仔细检查试剂的效期及完整性。若试剂出现变色、沉淀等异常情况,不得使用。

2.按照说明书要求,将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行稀释,稀释后的洗涤液应澄清无杂质。

3.酶结合物使用前应充分混匀,但避免剧烈振荡产生气泡。

加样

1.加样前轻轻混匀血清标本,使用移液器准确吸取样品、阴性及阳性对照100μl加入对应的酶标板孔中,加样过程中保持移液器垂直,避免挂壁和产生气泡,每加完一个样本更换吸头,避免交叉污染。

2.加样后,用封板膜封板,轻轻振荡酶标板使样品与板孔内包被抗原充分混合,确保反应体系均匀。

温育

1.将封好的酶标板放入37℃恒温培养箱中温育30分钟,温育过程中应保证培养箱温度恒定,避免温度波动影响检测结果。

2.温育结束后,轻轻取出酶标板,将封板膜弃去。

洗涤

1.采用自动洗板机时,将稀释好的洗涤液注入洗板机贮液槽,设置洗板程序为洗涤5次,每次浸泡30秒,最后拍干酶标板;采用手工洗板时,每孔加满洗涤液,浸泡30秒后拍干,重复操作5次。

2.洗涤过程中应注意避免孔内残留洗涤液影响后续反应,拍干时要在干净的吸水纸上用力拍干,但不可过猛以免损坏酶标板。

加酶结合物

1.取出酶结合物,轻轻混匀,用移液器每孔加入100μl,加样时同样要避免产生气泡和交叉污染。

2.加完酶结合物后,再次用封板膜封板,轻轻振荡混匀。

二次温育

将酶标板再次放入37℃恒温培养箱中温育30分钟,温育条件与第一次温育相同。

二次洗涤

按照前面洗涤步骤,用洗涤液对酶标板进行5次洗涤,确保洗去未结合的酶结合物,拍干酶标板。

加底物溶液

1.分别吸取底物A液和底物B液各50μl,依次加入酶标板孔中,加入后轻轻振荡混匀。

2.加底物溶液时应避免阳光直射,因为底物溶液对光敏感,光照可能会导致底物分解,影响显色结果。

显色

将酶标板避光放置于室温(18-25℃)环境中显色15分钟,显色过程中应避免振动和强光照射,同时可观察阳性对照孔逐渐显色,便于判断显色进程。

终止反应

每孔加入50μl终止液,加入终止液后应立即振荡混匀,此时溶液颜色由蓝色变为黄色。

结果判读

1.肉眼判读:在白色背景下与阴、阳性对照比较,如样品孔颜色深于阴性对照孔、与阳性对照孔颜色相近则判为阳性;样品孔颜色浅于阴性对照孔则判为阴性;样品孔颜色与阴性对照孔相近难以区分时判为可疑,需重新检测。

2.酶标仪判读:将酶标仪波长调至450nm,用空白孔调零后测定各孔吸光度值(OD值)。

3.计算临界值(Cut-off值):通常临界值=阴性对照平均OD值×2.1(若阴性对照平均OD值小于0.05,则以0.05计算)。

4.结果判断:样品OD值大于或等于临界值判为阳性,样品OD值小于临界值判为阴性。

质量控制

1.每次检测必须使用合格的阴、阳性对照,阴性对照孔OD值应小于临界值,阳性对照孔OD值应大于临界值,否则检测结果无效,需重新检测。

2.定期对酶标仪、移液器、洗板机等仪器设备进行校准和维护,确保仪器性能稳定可靠。

3.严格按照试剂盒说明书要求进行操作,注意试剂的储存条件和有效期。

废弃物处理

1.检测后的样品、废液、酶标板等废弃物应进行消毒处理,可采用含有效氯1000mg/L的消毒液浸泡2小时以上,或高压蒸汽灭菌处理。

2.消毒后的废弃物应按照生物安全废弃物处理规定进行处理,避免污染环境和传播病原体。

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