第4章 蛋白质的理化性质、分类及研究方法(1).ppt

1.凝胶过滤法测定蛋白质分子量依靠分子筛效应分离蛋白质，该方法适应球状蛋白的测定。五、蛋白质相对分子质量的测定蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形）分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。1）测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕2）以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线。3）再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕4）从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。相对分子质量的对数和洗脱体积之间呈线性关系。SDS和巯基乙醇存在的情况下，蛋白质在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子量的大小，与蛋白质本身电荷的多少和形状无关，即只有分子筛效应。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量lgMr=k-bmMr为相对分子质量，k为常数，b为斜率，m为迁移率。迁移率蛋白质一级结构测定

一级结构测定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。1.测定蛋白质分子中多肽链的种类和数目2.拆分蛋白质分子的多肽链3.断开多肽链内的二硫桥4.分析每一多肽链的氨基酸组成5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基6.裂解多肽链成较小的片段7.测定各肽段的氨基酸序列8.重建完整多肽链的一级结构9.确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置蛋白质测序的策略蛋白质的纯度：纯度97%以上，均一。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带。测序前的准备工作数目的确定：根据末端氨基酸的摩尔数与蛋白质摩尔数之比种类的确定：一般情况下，不同的多肽链一般含有不同的末端残基，因此如果测出末端多于一种，则表明该蛋白质是由两条或者多条肽链。方法：末端分析法（1）N-末端分析DNFB法PITC法DNS法氨肽酶法（2）C-末端分析肼解法羧肽酶法1.测定蛋白质分子中多肽链的种类与数目DNFB法：蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成黄色二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质）。产物在100℃高温的酸性环境下水解时，肽链断开，但DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析等方法分离，可以鉴定黄色的DNP氨基酸的类型。1945年由Sanger发明，故又称Sanger法。（1）N端分析PITC法：末端氨基与PITC（异硫氰酸苯酯）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在有机溶剂（如硝基甲烷）中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。该反应被Edman用来鉴定蛋白质N端，又称Edman法。DNS-Cl（丹磺酰氯）法：1956年hartley等提出，在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，生成DNS-肽链，后者在有机溶剂（如硝基甲烷）中与酸作用发生环化，生成相应的丹磺酰氨基酸而从肽链上掉下来。丹磺酰-氨基酸可用电泳等方法检测，同时丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol，故目前已经取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸。氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。氨肽酶(aminopeptidases)法序列：Gly-Ser-Val肼解法：多肽与肼（NH2NH2）在无水条件下加热（100℃5-10h），可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。用苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼（肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质），C端游离氨基酸留在上清，可用纸层析鉴定。但是精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。（2）C端分析羧肽酶法：羧肽酶是一类肽链外切酶，专一性的从肽链的C端逐个降解氨基酸。将蛋白质在pH8.0，30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸