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基因的克隆与表达

基因克隆(genecloning)基因表达(geneexpression)原核基因表达真核基因表达

基因克隆GeneCloning

概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程

一、概述添加标题提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码添加标题揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理添加标题确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质

1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞

基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。PARTONE

基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。

基因克隆的技术路线目的基因载体01体外重组02重组子（杂合DNA）03转化04受体细胞05筛选阳性克隆06大量扩增，获得子代DNA07

二、克隆载体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点

三、受体细胞定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性

四、体外重组的策略粘末端连接全同源粘末端连接最方便简单高背景-载体自身环化双向插入

2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平

2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大

人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段PARTONE

4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A

目录五、基因克隆的工作流程目的基因的获得1、直接分离点击此处添加正文，请言简意赅的阐述观点。3、构建cDNA文库点击此处添加正文，请言简意赅的阐述观点。4、PCR点击此处添加正文，请言简意赅的阐述观点。5、人工合成点击此处添加正文，请言简意赅的阐述观点。6、差异显示点击此处添加正文，请言简意赅的阐述观点。

直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库第一章节

logo构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(genelibrary)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

构建流程01添加标题抽提基因组DNA02添加标题鸟枪法制备DNA片段03添加标题DNA片段与载体重组04添加标题转化宿主菌05添加标题筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）06添加标题

01单击此处添加小标题特点及应用：03单击此处添加小标题构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）05单击此处添加小标题用于研究基因在基因组中的情况02单击此处添加小标题包含所有遗传信息04单击此处添加小标题筛选难度大

logo构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。

cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选

4、PCR扩增目的基因片段添加标题添加标题添加标题适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法

人工合成较短的DNA差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表达的基因

01单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。（二）体外重组02温度：粘末端连接：12-18℃连接体系的建立：03DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：平端连接时需加大酶量平末端连接：室温（低于30℃)

转化—Cacl2法、电击法重组子的筛选及鉴定筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序

基因的表达GeneExpression

表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。

据受体细胞的不同可分为：原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。真核表达系统：使外源