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核酸類藥物

?第一節核酸類物質的分離提取及其發酵生產

?一、RNA與DNA的提取與製備

（一）RNA的提取與製備

1、工業用RNA的提取

（1）RNA及其工業來源從微生物中提取RNA是工業上最實際和有效的方法。一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源，如酵母、白地黴、多種抗菌素的菌絲體——青黴素，制黴菌素等菌體。

通常在細菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在黴菌中占0.7%～28％。;在菌體內RNA含量的變化受培養基組成影響，其中關鍵是銨離子濃度和磷酸鹽濃度。培養酵母菌體收率高，易於提取RNA。

很顯然在許多酵母中，早期細胞中的RNA含量高，其確切數值取決於碳、氮比例和培養基組成等。

（2）高RNA含量酵母菌株的篩選可以從自然界篩選到RNA含量高的酵母菌株，也可用誘變育種的方法提高酵母菌的RNA含量。

;稀堿法：是用氫氧化鈉溶液（1%），使細胞壁變性，使核酸從細胞內釋放出來。需用酸中和PH7。然後除去菌體，將pH調至RNA的等電點（pH2.5），使RNA沉澱出來。上法的缺點是制得的RNAMr較低,(磷酸單脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3~4h破壞酶)。

濃鹽法：是用高濃度鹽溶液（6%~8%）處理，同時加熱，以改變細胞壁的通透性，使核酸從細胞內釋放出來。

要避免分子降解，可採用苯酚法製備RNA。用苯酚處理生物材料，使蛋白質變性，然後離心，上層水溶液內含有全部RNA，可用乙醇沉澱出來。;去氧核糖核蛋白溶於濃鹽溶液1mol/L,不溶於0.14mol/L,而核糖核蛋白溶於0.14mol/L鹽溶液。

（4）RNA的提取實例：啤酒酵母是提取RNA的很好的資源。取100g壓榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下緩慢攪拌30分鐘。用6mol／LHCl調至pH7，攪拌15分鐘，離心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl調pH2.5，置冷過夜，離心得RNAl.8g（純度80％）。

;（二）DNA的提取與製備

1．工業用DNA的提取

取新鮮冷凍魚精20kg，用絞肉機粉碎2次成漿狀，加入等體積水，攪拌均勻，傾入反應鍋內，緩慢攪拌，升溫至100℃，保溫15分鐘，迅速冷卻至20～25℃，離心除去魚精蛋白等沉澱物，獲得35L含熱變性DNA的溶液，經精確測???DNA含量後直接可用於酶法降解生產去氧核苷酸。如要製成固體狀DNA，在熱變性DNA溶液中逐漸加入等體積95％乙醇，離心可獲得纖維狀DNA，沉澱用乙醇、丙酮洗滌，減壓低溫乾燥得DNA粗品，產品含熱變性DNA50％～60％。

;2、具有生物活性DNA的製備

動物內臟（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理鹽水經組織搗碎機搗碎1分鐘，勻漿於2500r／pm離心30分鐘，沉澱用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗後離心，將沉澱懸浮於20倍重量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶劑）十二烷基磺酸鈉，並攪拌2～3小時，在0℃2500r／pm離心，在上層液中加入等體積的冷95％乙醇，離心即可得到纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫乾燥得粗品DNA。粗品DNA溶於適量蒸餾水，加入5％十二烷基磺酸鈉達1／10體積，攪拌1小時，經5000r／pm離心1小時，清液中加入NaCl達1mol／L，再緩慢加入冷95%乙醇，DNA析出，經乙醇、丙酮洗滌，真空乾燥得具有生物活性的DNA（活性DNA製備需在0～3℃操作）。;二、用酶解法、發酵法和半合成法制備核苷酸

（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸

1、酶解法製備去氧核苷酸

桔青黴產生5`-磷酸二脂酶

紅酵母產生3`-磷酸二脂酶;;2、酶解法製備戊糖核苷酸

我國從60年代開始使用核酸酶P1降解核糖核酸生產單核苷酸，日本年產呈味核苷酸（肌苷酸和鳥苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產的。

酶解法生產5‘—單核苷酸工藝流程

;;3、雙酶法生產肌苷酸和鳥苷酸（I＋G）

呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商品名簡稱為（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可獲得GMP和AMP，其中AMP經脫氨生成IMP。雙酶法生產（I十G）工藝。;4．菌體自溶法生產核苷酸

磷酸二酯酶在合適的條件下降解細胞內的RNA可產生5′-核苷酸。在國內用谷氨酸產生菌體自溶法生產5‘-核苷酸。

（1）菌體自溶法生產核莆酸工藝流程：;5．堿水解法生產2＇，3＇-混合核苷酸

RNA結構中的磷酸二酯鍵對於鹼性條件不穩定，很容易生成2′，3