血清蛋白聚丙烯酰胺电泳.pptVIP

血清蛋白聚丙烯酰胺电泳第1页，共31页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的＊学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理＊掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术第2页，共31页，星期日，2025年，2月5日(一)电泳的含义

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。

电泳的应用

1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等

2.分析某种物质的纯度及分子量3.电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析4.免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力二、实验原理第3页，共31页，星期日，2025年，2月5日第4页，共31页，星期日，2025年，2月5日待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。电泳的影响因素第5页，共31页，星期日，2025年，2月5日支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性；缓冲液通常要保持一定的离子强度，强度过低，则缓冲能力差，不易维持pH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。第6页，共31页，星期日，2025年，2月5日(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法,由丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法.第7页，共31页，星期日，2025年，2月5日1.凝胶聚合催化体系化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称AP）。在催化剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，由AP形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低pH下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。第8页，共31页，星期日，2025年，2月5日

（1）光催化：核黄素

（2）化学催化：AP-TEMED催化体系TEMED（四甲基乙二胺）催化AP（过硫酸胺）生成硫酸自由基：S2O82－2SO4·ˉ硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：第9页，共31页，星期日，2025年，2月5日Bis将单体长链间连成网状结构：第10页，共31页，星期日，2025年，2月5日化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：?催化剂和加速剂的浓度?pH碱性条件?温度?分子氧?杂质第11页，共31页，星期日，2025年，2月5日分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2.凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 第12页，共31页，星期日，2025年，2月5日3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高