蛋白原核表达与纯化-(新生培训)-2(1).pptxVIP

蛋白原核表达与纯化-(新生培训)-2

MolecularMicrobiologyFoodSafetyLaboratory

PartI蛋白的原核表达

PartⅡ蛋白纯化

原核表达策略选择

表达结果检测

常见问题与实验例

PartI蛋白的原核表达

最通用的原核表达系统

大肠杆菌(Escherichiacoli)

◆遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；

◆基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结构),无蛋白加工等修饰；

◆常见的原核表达载体：pET系列(T7promoter,Novagen公司);pQE系列(T5promoter,Qiagen公司);pGEX系列(GST融合表达，GE公司);pBAD系列(Arabinose诱导型)

Expression

hostcellO

重组基因转化入宿主菌中

外源基因在大肠杆菌中表达流程

基因——载体——菌株——培养

目的基因插入表达载体

外源基因的表达

目的基因扩增

Expressionvector

Plasmidvector

Targetgene

系统名称

公司

启动子

抗性

常用标签特点

pGEX

GE

tac

Amp

GST·Tag

可溶性表达，纯化难以控制，

谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋

白纯度较低，通常需要去掉GST·Tag

可溶性表达，纯化难以控制，

pMal

NEB

tac

Amp

MBP·Tag

麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低，通常需要去掉

MBP·Tag

pET

Merck

(Novagen)

T7

T7lac

AmpKan

His·Tag

种类丰富。标签小，无需切割，

一般来说，对蛋白活性无影响。

纯化及其方便。

pEASY

Transgen

T7lac

Amp

His·Tag同pET系统

常用原核表达载体系统

◆pET系统最初由Studier及其同事构建(StudierandMoffatt,1986),是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统；

◆目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

◆T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。

pET表达载体系统

kan

Vectoramp²

TT/acT7

His*TagTT*TagTrx*TagKSIPKAGST·Tagsignalseq.

f1onlT7sTagS*TagCBD*TagHSVsTagDsb·TagproteaseLICavail

pET-33-C

N

PET-58-C

N

pET-9a-d

●

·

N

pET-113-0

N

pET-123-C

pET-14D

N

T

pET.15b

·

·

N

T

pET-160

·

M

X

pET-17b

N

pET-17b

N

pET-190

N

E

pET-20b(+)

●

C

PET-213-4(t)

●

C

N

PET-22b(+)

C

pET-233-(4)

●

C

N

PET-243-d(+)

●

·

●

C

N

pET-250(+)

●

C

C

●

pET-26D(t)

●

●

C

pET-27b(+)

●

C

C

pET-283-0(t)

●

●

N.C

1

T

pET.29a-c(+)

·

·

C

N

T

pET-300-0(4)

·

N.C

I

T,E

pET-30Ek/LC

·

●

N.C

I

T,E

pET-30XaLIC

●

N.C

1

T,X

pET-310(+)

●

·

C

N

pET-32a.c(+)

·

·

●

LC

I

N

TE

pET-32EK/LC

●

●

●

L.C

1

N

T,E

●

PET-32XaLIC

●

·

LC

1

N

L,X

●

PET-33D(+)

N,C

I

N

T

PET-34D(t)

●

C

I

M

T,E

pET-35b+)

●

C

I

N

T,X

pET-36b(t)

●

●

C

I

N

T.E

●

●

pET-37b(+)

·

·

C

I

N

T.X

·

pET-38D(+)

●

C

I

C

T

pET-390+)

●

·

●

LC

T