TSAIA_0042021_猪瘟病毒PPAELISA抗体检测方法.docxVIP

ICS65.020.20

B38

团体标准

T/SAIA004—2021

猪瘟病毒PPA-ELISA抗体检测方法

PPA-ELISAtodetectantibodyagainstclassicalswinefevervirus

2021-12-20发布 2021-12-20实施

山东省农业产业化促进会发布

T/SAIA

T/SAIA004—2021

T/SAIA

T/SAIA004—2021

前 言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。

本文件由山东省农业产业化标准委员会提出并归口。

本标准起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司、滨州市农业技术推广中心、日照市东港区动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：王金良、沈志强、孟卫芹、谢金文、李娇、高青华、董林、肖跃强、刘通、陈金龙、董炳梅、许崇友、姚春阳、魏凤、马力、李坤林。

PAGE

PAGE1

PAGE

PAGE2

猪瘟病毒PPA-ELISA抗体检测方法

范围

本标准规定了猪瘟病毒抗体PPA-ELISA检测方法。

本标准适用于猪、兔等动物猪瘟病毒抗体检测，但无法区分疫苗抗体和野毒感染抗体。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB19489 实验室生物安全通用要求

NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

下列缩略语适用于本文件。

CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）

ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）

SPA：葡萄球菌A蛋白（StaphylococcalProteinA）PPA：辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）OD：光密度（OpticalDensity）

设备和器材

微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL）。

离心机（离心速度可达6000r/min以上）。

37℃温箱。

酶标读数仪（包括450nm波长）。

一次性注射器（5mL～10mL）。

T/SAIA

T/SAIA004—2021

T/SAIA

T/SAIA004—2021

试剂

猪瘟病毒E2重组蛋白

克隆猪瘟病毒E2抗原优势区基因，用pET32a（+）表达载体进行表达，亲和层析法纯化重组蛋白。获得重组蛋白纯度应≥95%。见附录A。

标准阳性血清

猪瘟疫苗免疫仔猪制备，免疫前荧光抗体病毒中和试验检测为阴性，免疫后猪瘟抗体正向间接血凝效价达到1：28以上。

标准阴性血清

无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。

包被液：见附录B.1。

20×浓缩洗涤液：见B.2。

封闭液：见B.3。

样品稀释液：见B.4。

HRP-SPA稀释液：见B.5。

酶标结合物：商品化的HRP标记的葡萄球菌A蛋白。

底物液A：见B.6。

底物液B：见B.7。

终止液：见B.8。

实验用水：符合GB/T6682中三级水的标准。

商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。

血清样品的处理

样品采集及处理

采集静脉血时，注射器不能重复使用，每头猪采血不少于2mL。待血液室温自然凝固后分离血清，4000r/min离心3min～5min，用移液器吸出100μL的上层血清。

血清样本的存放与运送

血清样本若在一周内检测，可置4℃冰箱中保存。若超过一周检测，应置-20℃以下冷冻保存。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

PPA-ELISA抗体检测操作方法

包被抗原

以纯化的猪瘟病毒E2蛋白做为包被抗原，用包被液稀释至1?g/mL，每孔加入100?L，4℃包被16h～18h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入250?L的1?洗涤液，振荡洗涤2次，每次2min～3min。

封闭

每孔加入200?L封闭液，室温放置2.5h，弃掉孔内封闭液，洗板同上。

一抗孵育

在A1和A2孔中分别加入100μL阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μL阳性对