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百日咳实验室检测技术指南

一、百日咳概述

百日咳是由百日咳鲍特菌引起的一种急性呼吸道传染病，临床特征为阵发性、痉挛性咳嗽，以及咳嗽终止时伴有鸡鸣样吸气吼声。该病病程较长，未经治疗，咳嗽症状可持续2-3个月，故有“百日咳”之称。百日咳传染性强，人群普遍易感，尤其是婴幼儿感染后可能出现严重并发症，甚至危及生命。准确、及时的实验室检测对于百日咳的诊断、治疗和防控至关重要。

二、标本采集

（一）采集时间

标本采集时间对百日咳检测结果影响显著。在疾病早期（卡他期），即症状出现后的1-2周内采集标本，此时细菌在呼吸道大量繁殖，检出率较高。随着病程进展，进入痉咳期后，细菌数量逐渐减少，检测阳性率会有所下降，但仍可采集标本进行检测。

（二）采集方法

1.鼻咽拭子

-用无菌拭子经鼻孔轻轻插入，沿下鼻道底部向后缓慢推进，直到遇到阻力（约距离鼻孔5-6cm），旋转拭子以获取鼻咽部黏膜表面的分泌物，然后小心取出拭子。

-操作时应避免拭子碰到口腔、舌头等部位，防止标本被污染。

2.鼻咽吸出物

-使用吸引器连接无菌吸头，经鼻孔插入鼻咽部，轻轻抽吸以获取分泌物。

-该方法能收集到较多的标本，适用于婴幼儿，但操作相对复杂，需要专业人员进行。

（三）标本保存与运输

采集后的标本应立即放入含有适当转运培养基的无菌容器中，如Stuart培养基或Amies培养基。若不能及时送检，标本可在4℃保存24-48小时。如需长时间保存，应置于-70℃冰箱。运输过程中需使用冷藏箱保持低温，并尽快送达实验室。

三、细菌学检测

（一）直接涂片镜检

1.原理

百日咳鲍特菌为革兰氏阴性短小杆菌，通过直接涂片染色后在显微镜下观察细菌形态，可初步判断是否存在百日咳鲍特菌。

2.操作步骤

-将采集的鼻咽拭子标本均匀涂抹在载玻片上，自然干燥后用甲醇固定。

-进行革兰氏染色，先用结晶紫初染1分钟，水洗；再用碘液媒染1分钟，水洗；然后用95%乙醇脱色30-60秒，水洗；最后用稀释复红复染30秒，水洗，干燥。

-在油镜下观察，百日咳鲍特菌呈革兰氏阴性，两端着色较深的短小杆菌。

3.结果判断

若镜下发现典型的革兰氏阴性短小杆菌，可作为初步诊断的参考，但直接涂片镜检的特异性和敏感性较低，不能作为确诊依据。

（二）细菌培养

1.原理

百日咳鲍特菌营养要求较高，需在含有特殊营养成分的培养基上才能生长。通过将标本接种到合适的培养基上，在适宜的条件下培养，使细菌生长繁殖，然后根据菌落特征进行鉴定。

2.培养基选择

常用的培养基有鲍-金（Bordet-Gengou）培养基和活性炭酵母浸膏（Regan-Lowe）培养基。鲍-金培养基含有甘油、马铃薯、血液等成分，能较好地支持百日咳鲍特菌生长，但易受杂菌污染；活性炭酵母浸膏培养基含有活性炭、酵母浸膏等成分，可吸附有害物质，减少杂菌生长，提高百日咳鲍特菌的分离率。

3.接种方法

将采集的鼻咽拭子标本直接在培养基表面划线接种，尽量使标本均匀分布。也可将鼻咽吸出物标本用无菌吸管吸取适量，滴加在培养基表面，然后用接种环划线分离。

4.培养条件

接种后的培养基置于35-37℃、含5%-10%二氧化碳的培养箱中培养。一般培养2-3天开始出现菌落，培养5-7天可进行鉴定。

5.菌落特征

百日咳鲍特菌在鲍-金培养基上形成细小、光滑、凸起、银灰色、有珠光色泽的菌落，周围有狭窄的溶血环；在活性炭酵母浸膏培养基上形成灰色、湿润、有光泽的菌落。

6.鉴定方法

-生化鉴定：对培养出的菌落进行一系列生化试验，如氧化酶试验、触酶试验、尿素酶试验等。百日咳鲍特菌氧化酶阳性、触酶阳性、尿素酶阴性。

-血清学鉴定：用百日咳鲍特菌特异性抗血清进行玻片凝集试验，若出现凝集现象，则可确定为百日咳鲍特菌。

7.结果判断

细菌培养是诊断百日咳的“金标准”，但培养时间较长，且阳性率受标本采集时间、运输条件等因素影响。若培养出典型菌落并经鉴定为百日咳鲍特菌，则可确诊。

四、血清学检测

（一）原理

人体感染百日咳鲍特菌后，免疫系统会产生特异性抗体，通过检测血清中这些抗体的水平，可以辅助诊断百日咳。常用的检测抗体包括IgM、IgG和IgA。

（二）检测方法

1.酶联免疫吸附试验（ELISA）

-操作步骤

-包被抗原：将百日咳鲍特菌的抗原（如百日咳毒素、丝状血凝素等）包被在微孔板上。

-加样：加入待检血清标本，孵育一段时间，使血清中的抗体与包被抗原结合。

-加酶标抗体：加入酶标记的抗人免疫球蛋白抗体，孵育后使酶标抗体与结合在抗原上的抗体结合。

-加