山奈酚对山羊中性粒细胞损伤精子的保护作用的初步研究.pdfVIP

资助项目：国家自然科学基金项目

广东省基础与应用基础基金

（2022A1515010960）

摘要

精子因损伤而导致活力低下是山羊繁殖障碍的主要原因之一。在人工授精

或自然配孕，微生物会伴随精子进入母羊生殖道，大量中性粒细胞会被募集至

生殖道抵抗微生物感染。中性粒细胞清除微生物病原的同时也会损伤或降低精

子活力，导致母羊受孕率下降甚至引起繁殖障碍问题。中性粒细胞胞外诱捕网

（NETs）是一种由中性粒细胞为捕获病原体而释放的网状结构。研究表明，

NETs的形成会导致活性氧（ROS）的产生，同时过量ROS会导致精子质膜的损

伤。山奈酚是一种天然的易获取的黄酮类化合物，其具有的功效有抗癌、抗氧

化、抗炎等，但山奈酚对山羊中性粒细胞损伤精子的影响尚未见报道。本论文

拟在山羊中性粒细胞损伤精子的初步研究基础上，探讨山奈酚对山羊精子的保

护效果，旨在初步解析山奈酚对中性粒细胞损伤精子或降低精子活力的保护机

制，为山羊精液功能稀释剂的开发提供参考。

初步研究母羊中性粒细胞损伤山羊精子的过程。中性粒细胞与精子（1:3）

共孵育，激光共聚焦观察山羊精子诱导母羊中性粒细胞释放NETs形态特征；荧

光酶标仪定量分析NETs的释放情况；倒置显微镜下观察并统计山羊精子直线运

动率（活力）和存活率，同时观察并计数精子质膜完整性，评估精子的损伤情

况。结果证实，山羊精子和酵母聚糖可以诱导典型的NETs结构，而DNaseI

（NETs的标准降解剂）显著降解NETs；山羊精子诱导NETs的释放机制依赖于

NADPH氧化酶、ERK1/2、p38信号通路和糖酵解途径；山羊中性粒细胞显著降

低精子的活力、活率和精子质膜结构完整性，而DNaseI显著提高山羊精子的活

率和活力、保护精子质膜完整性。以上结果初步表明，母羊中性粒细胞会通过

释放NETs来损伤山羊精子。

其次，山奈酚降低山羊精子诱导母羊中性粒细胞释放的NETs水平。山奈酚

（25μM、50μM和100μM）通过与母羊中性粒细胞和山羊精子（1:3）共孵育，

CCK-8检测山奈酚对母羊中性粒细胞和山羊精子细胞活性影响，确定山奈酚的

最佳使用剂量；激光共聚焦观察山奈酚对山羊精子诱导NETs释放的情况；荧光

酶标仪定量分析NETs的释放水平；2，7-二氯荧光素（DCFH-DA）检测山奈酚

对山羊精子诱导ROS释放影响。结果证实，山奈酚（25μM、50μM和100μM）

对母羊中性粒细胞和山羊精子均无毒性作用；山奈酚显著降低山羊精子诱导的

NETs和ROS释放水平。结果表明，山奈酚可以显著抑制山羊精子诱导NETs释

放。

最后，山奈酚对母羊中性粒细胞损伤精子的保护效果观察。姬姆萨染色检

测山羊精子的顶体完整性；低渗肿胀试验检测山羊精子的质膜完整性；倒置显

微镜下观察并统计精子活力、活率、精子质膜和顶体完整性，综合评估精子的

损伤情况；试剂盒检测山羊精子和母羊中性粒细胞的氧化和抗氧化酶水平。结

果证实，山奈酚显著提高山羊精子的活力和活率，保护精子的质膜和顶体完整

性；山奈酚显著促进抗氧化酶GSH-Px和CAT水平、降低氧化酶MDA水平，

有效缓解氧化应激失衡。结果表明，山奈酚对于母羊中性粒细胞损伤精子具有

明显的保护作用。

综上所述，母羊中性粒细胞损伤山羊精子的过程与NETs释放相关，而山奈

酚可以通过抑制中性粒细胞释放NETs保护山羊精子。论文初步研究了山羊中性

粒细胞损伤精子的过程，为山奈酚作为候选精液稀释液添加组分提供试验依据，

同时也为兽医临床实践中有效提高畜牧养殖业的受孕率提供试验参考。

关键词：山奈酚；中性粒细胞胞外诱捕网；精子活力；精子活率；山羊

ABSTRACT

Lowvitalitycausedbyspermdamageisoneofthemaincausesofreproductive

disordersingoats.Inthesituationofartificialinseminationornaturalconception,