嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶和黑曲霉葡萄糖淀粉酶的分子改造与协同催化研究.pdfVIP

摘要

淀粉酶是一类能够催化淀粉水解反应的酶类，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、

葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。淀粉酶广泛应用于食品工业、饲料工业、生

物燃料生产等领域，其活性和热稳定性直接影响到工业生产的效率和成本。因此，

开发具有高活性和热稳定性的淀粉酶对于提高淀粉加工工业的生产效率、降低成本

具有重要意义。

本研究中利用NRI模型模拟了嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶在水相中的分子动

力学，以预测环区内的运动途径。基于结构信息的深度学习对该路径上的氨基酸进

行设计改造，选定10个突变组合并开展酶学特性的研究。经过修饰的氨基酸突变体

在底物特异性、酶动力学、最适温度和热稳定性方面存在显著差异。突变体P44E,

Y359T和D366L对底物的亲合性明显提高，KM值相比野生型淀粉酶分别减小了

39.1%，54.3%和33.7%。同时，突变体P44E，K345I和Y359T对淀粉底物的催化效

率（kcat/KM）显著提高，分别比野生型淀粉酶提高了93.6%，4.25%和27.1%。在底

物特异性方面，突变体P44E，K345I，Y359T和C361M对土豆淀粉的水解能力比野

生型分别提高95%，68%，74%和33%。其中P44E的对土豆淀粉水解活性和对淀粉

的催化效率（kcat/KM）分别比野生型提高了95.0%和93.6%，最适温度提高到90℃，

表现出更强的最适温度和热稳定性。这种从脯氨酸到谷氨酸的突变增加了通道瓶颈

的数量和半径，这可能有助于将淀粉底物运输到酶中。该突变还优化了催化中心的

氢键网络，减小底物进出催化中心的空间阻碍。

本研究基于黑曲霉葡萄糖淀粉酶的三维结构，对催化结构域内的残基进行了截

短设计，选定了4个突变体并开展酶学特性的研究。结果表明，突变体GLA-2的热

稳定性和pH稳定性在一定程度上有所提高。其中突变体GLA-1和GLA-2对淀粉底

物的亲和能力显著提高，相较于野生型，KM值分别减少了40.7%和52.5%，此外突

变体GLA-2的催化效率（kcat/KM）比野生型提高了194.9%。本研究对催化结构域中

靠近口袋中心残基进行截短设计，可能导致活性口袋的结构变得不稳定，使口袋结

构的柔性降低，但也增强了与底物的结合亲和力，提高了酶的催化效率。

本实验通过测定前期所得的α-淀粉酶突变体P44E和糖化酶突变体GLA-2共同

水解淀粉的速率，研究了α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶对底物的协同作用。结果表明，

在一定条件下，不同比例的α-淀粉酶和糖化酶能够产生协同作用，其水解淀粉的效

率明显高于单独使用其中一种酶的情况。这种协同作用可以提高淀粉的水解效率，

使得底物更有效地转化为葡萄糖，为后续的代谢过程提供能量和原料。

关键词：α-淀粉酶；葡萄糖淀粉酶；结构功能分析；热稳定性；协同作用

ABSTRACT

Amylaseisagroupofenzymescapableofcatalyzingthehydrolysisreactionofstarch,

mainlyincludingα-amylase,β-amylase,glucoamylase,isoamylase,andpullulanase.

Amylaseiswidelyusedinfoodindustry,feedindustry,biofuelproduction,etc.,andits

activityandthermalstabilitydirectlyaffecttheefficiencyandcostofindustrialproduction.

Therefore,thedevelopmentofamylaseswithhighactivityandthermalstabilityisofgreat

significanceforimprovingtheproductionefficiencyandreducingthecostofstarch

processingindu