蛋白质浓度测定方法比较.pptVIP

第1页，共15页，星期日，2025年，2月5日1、0.1g细胞→2mlepp，混匀。2、＋700μlbufferA，65℃，10m’，中间混匀一次3、＋苯酚350μl，＋氯仿350μl，混匀3m，12000rpm，5m’4、上清500μl至1.5mlepp，＋500μl（等体积）氯仿，混匀3m’，12000rpm，10m’5、上清400μl到1.5mlepp，＋异丙醇400μl（0.7-1×），12000rpm，2m’，（掏出DNA，毛细管）6、沉淀用70%乙醇洗2次，每次3m’7、自然凉干（10m’），＋30μlTE，充分溶解8、琼脂糖凝胶电泳鉴定第2页，共15页，星期日，2025年，2月5日蛋白质浓度测定方法比较第3页，共15页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。第4页，共15页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理与步骤OH－磷钼酸、磷钨酸Pr+CuSO4→→→Pr-Cu络合物（紫红色）→→→蓝色化合物蛋白质测定的范围：25－250μg/mL标准蛋白BSA250μg/mL测定波长：660nm1、Lowry法（Foling-酚法）反应原理：第5页，共15页，星期日，2025年，2月5日测定步骤：标准蛋白BSA250μg/mL（1）依次向试管中加入试剂：（2）A660——[Pr]作图，求待测蛋白浓度管号123456待测1待测1，BSA(mL)00.20.40.60.81.01.01.0D.W(mL)1.00.80.60.40.2000[Pr](μg/mL)试剂甲（mL）5.0室温反应10分钟（双缩脲反应）试剂乙（mL）0.5立即振摇，30℃水浴20分钟A660第6页，共15页，星期日，2025年，2月5日原理：蛋白质分子中Tyr,Try,Phe的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有UV吸收的性质，吸收高峰在280nm处。测定范围：0.1－1mg/mLpr测定波长：280nm标准蛋白BSA：1mg/mL测定步骤：（1）向各试管中依次加入各种试剂：（2）以A280nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度管号123456待测1待测1，BSA（mL）00.51.02.03.04.04.04.0D.W(mL)4.03.53.02.01.0000[Pr](mg/mL)A280nm2、紫外线（UV）吸收法：第7页，共15页，星期日，2025年，2月5日3、考马斯亮蓝显色法（Bradford法）实验原理：[Pr]↑→→→→CBBG-250-Pr复合物↑→→→A595↑标准蛋白BSA：250μg/mL操作步骤：（1）依次向各试管中加入各种试剂：（2）以A595nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度管号123456待测1待测1，BSA（mL）00.20.40.60.81.01.01.0D.W(mL)1.00.80.60.40.2000[Pr](μg/mL)CBBG-250（mL）5.0A595nm第8页，共15页，星期日，2025年，2月5日蔗糖酶km值的测定第9页，共15页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的：掌握sucrose酶的km测定的实验方法。二、实验原理：蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖+水→→G+F每水解1molS，生成2mol还原糖，因此可用比色皿测定还原糖量，即可知底物的水解速度。还原糖可还原3，5-二硝基水杨酸（DNS）生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水杨酸。第10页，共15页，星期日，2025年，2月5日三、实验步骤管号蔗糖（ml）H2O（ml）123456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521↓每管加酶液0.5ml↓37℃准确作用5min↓NaOH0.5ml↓每管取0.5ml↓DNS0.5ml↓沸水浴3min↓冷却↓DW4ml↓A520取8只试管，按下表分别加入如下试剂：以1/A520——1/S作图，求Km第11页，共15页，星期日，2025年，2月5日