荧光光谱在蛋白质研究中应用.pptxVIP

荧光光谱在蛋白质研究中应用;一、基本原理;2、荧光的寿命：10-8―10-4s

3、磷光的寿命：10-4―102s

4、紫外的寿命：10-15s

紫外观察不到的过程，其它两种光谱可以观察到，如生色团及其环境的变化。

5、由于它是发射光谱，所以灵敏度很高。

6、磷光

;二、仪器结构与主要光谱参量;2、主要光谱参量

（1）吸收谱、荧光激发光谱、及荧光发射光谱

N-甲基咔唑在环己烷

;;;（2）荧光寿命

去掉激发光后，分子的荧光强度(I0)将到1/e?I0所需要的时间，用?表示，?=1/k。如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，荧光寿命称为?F,它与kF（荧光发射速率常数）成反比，?F可以给出有关分子结构和动力学方面的信息。

（3）量子产率

表示物质发射荧光的效率，用?表示。发射荧光分子在全部退激分子中所占比例。;（4）荧光强度

F(I)=kP0C

三、影响荧光的因素

1、荧光与化合物的结构

（1）跃迁类型

?*??能发出较强的荧光，所以???*是产生荧光的主要类型，主要是由于？。

（2）共轭效应

增大荧光物质的?，从而使更多分子处于激发态，有利于荧光的发射。

（3）刚性结构与共平面效应

（4）取代基效应

给电子基团如：-OH,-NH2,-OCH3,通过p-?共轭，增强荧光.

吸电子基团如：-NO2,-COOH,降低荧光.;;（5）溶剂的影响

极性增加，发生红移。（1-氨基-8-萘磺酸酯），从辛醇?乙二醇，红移且强度降低。

;（6）荧光淬灭因素

a.碰撞淬灭

b.能量转移

c.氧的淬灭作用

d.自淬灭

e.光照;四、荧光在蛋白质研究中的应用;反应计量比的测定;反应动力学;2.Ca2+对phospho-calsequestrin蛋白的影响

荧光增强且蓝移表明:Trp的微环境从极性表面转移到疏水内部.;3.Zn2+对氨基酰化酶的影响:

荧光降低且红移,Trp从疏水内部向外部移动.;4.外源荧光的应用;5、共振能量转移;荧光共振能量（FRET）转移及应用;非辐射能量转移;给予体和接受体的共振能量转移能级图;能量转移效率;RO值的计算;荧光共振能量转移的基本条件;给予体和接受体对;四甲基罗丹明碘乙酰胺;菁染料Cy5;

5-((((2-IODOACETYL)AMINO)ETHYL)AMINO)

NAPHTHALENE-1-SULFONICACID,IAEDANS

5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸

;Msx(Msx-homeodomain);研究α型和突变体π型胞浆

谷胱甘肽转移酶的区别;ApplicationofFRETtotheGroEL–GroESChaperoninReaction,

GroEL(EL315C+IAEDANS)EL513-D,GroES(ES98C+F5M)ES98-A

;;6、绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白空间结构(GreenFluorescenceProtein):1962年在水母中分离得到。它由11个?-折叠围绕成一个?-折叠桶，结构中唯一的一个?-螺旋在桶的中间。;?-螺旋包括一个氨基酸三联体：residues65-67,Thr-Tyr-Gly，被埋在疏水的蛋白质中间可以防止氧以及溶剂对荧光的淬灭。a图为GFP;b是一种从珊瑚中发现的红色荧光蛋白DsRed。;;GFPhasanumberofamazingpropertiesthatenableitsuseforinvivoimaging.

Firstly,GFPcanbeexpressedinavarietyofcells,whereitbecomesspontaneouslyfluorescentwithouttheaidofacofactor.

Secondly,GFPcanbefusedtoahostproteintocreateafusionproteinthatusuallyretainsboththefluorescenceoftheGFPandthebiochemicalfunctionoftheorig