第六章电泳技术.pptVIP

三、PAGE凝胶电泳操作1、配制缓冲液；2、配制凝胶3、加样4、安装装置5、电泳：电场强度为10~25V/cm,0.5~2h.6、显色:染色、漂洗、检测第29页，共68页，星期日，2025年，2月5日PAGE电泳操作PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类：连续电泳体系只有一层凝胶，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续电泳体系采用二层或三层性质不同的凝胶，由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。第30页，共68页，星期日，2025年，2月5日不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶。第31页，共68页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶垂直管型盘状电泳第32页，共68页，星期日，2025年，2月5日夹心垂直电泳示意图凝胶膜示意图聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳第33页，共68页，星期日，2025年，2月5日四、不连续凝胶电泳的特点在不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。第34页，共68页，星期日，2025年，2月5日1．样品浓缩效应(1)凝胶孔径的不连续性样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。第35页，共68页，星期日，2025年，2月5日2．分子筛效应大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋自质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。第36页，共68页，星期日，2025年，2月5日图中圆球分别代表大、中、小3种不同分子量的蛋白质。大、中、小分子分别滞留在与分子大小相当的凝胶孔径中，不再前进，因而分离成3个区带。第37页，共68页，星期日，2025年，2月5日3．电荷效应在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。第38页，共68页，星期日，2025年，2月5日A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶第39页，共68页，星期日，2025年，2月5日A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH6.8)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶第40页，共68页，星期日，2025年，2月5日A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶第41页，共68页，星期日，2025年，2月5日A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶第42页，共68页，星期日，2025年，2月5日A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶第43页，共68页，星期日，2025年，2月5日B.电荷效应蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH8.9)，Gly－解