第二章第二节基因工程四要素.pptVIP

单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶能够从5′-末端或3′-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。主要的催化活性是催化双链DNA按3′→5′的方向从3′-OH末端释放5′-单核苷酸。第29页，共67页，星期日，2025年，2月5日基因工程应用：P26—粘性末端→平末端第30页，共67页，星期日，2025年，2月5日7、碱性磷酸酯酶：alkalinephosphatase最适pH在7.0以上，催化各种磷酸单酯键水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转移反应，但不能水解磷酸二酯键。应用：P26第31页，共67页，星期日，2025年，2月5日8、RNA酶RNase：RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子存在范围广第32页，共67页，星期日，2025年，2月5日总之限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸外切酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰RNA酶---分解RNA其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等第33页，共67页，星期日，2025年，2月5日1、载体：将外源DNA或基因携带入适当宿主细胞（hostcell）的工具。二、基因克隆载体P27 第34页，共67页，星期日，2025年，2月5日2、载体的种类克隆载体：携带重组DNA进入在宿主细胞内进行大量复制形成大量的基因克隆。被克隆的基因不一定会表达但一定被大量复制质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。人工染色体载体P33：大DNA片段克隆载体表达载体：使目的基因表达，生产出我们需要的产物。第35页，共67页，星期日，2025年，2月5日2、载体具备的条件具有较高的拷贝数染色体复制起点染色体外复制起点——质粒复制起点具种的特异性分子量过大可转移性低利于载体的制备以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞或筛选作用多克隆位点第36页，共67页，星期日，2025年，2月5日(掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体载体P28-35)

你对天然质粒了解多少？第37页，共67页，星期日，2025年，2月5日（1）可转移性F质粒：F因子或性因子R质粒：抗药性因子Col质粒：大肠杆菌素因子第38页，共67页，星期日，2025年，2月5日（2）自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系第39页，共67页，星期日，2025年，2月5日（3）质粒的拷贝数根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：1--3拷贝，属低拷贝型，受宿主染色体基因控制松弛型复制控制的质粒：10--60拷贝，属高拷贝型，受宿主染色体基因控制较弱第40页，共67页，星期日，2025年，2月5日（4）标记基因A、选择标记基因——用于鉴别、指示目的DNA（载体）是否进入了宿主细胞（有可能是空载）P27\45。抗生素抗性基因，使用最广泛。a.氨苄青霉素抗性基因（Ampr）杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。第41页，共67页，星期日，2025年，2月5日b.四环素抗性基因（Tetr）抑菌剂，Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。第42页，共67页，星期日，2025年，2月5日c.氯霉素抗性基因（Cmr）抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶