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菌种保存、传代、使用、销毁管理规程操作规程

一、总则

1.目的

规范菌种从获取、保存、传代、使用到销毁的全流程管理，确保菌种遗传稳定性、纯度及使用安全性，防止菌种污染、流失或滥用，适用于微生物实验室、生物制药、食品检测等涉及菌种操作的场景。

2.适用范围

本规程涵盖标准菌株（如ATCC、CMCC菌株）、分离菌株（如临床分离菌、环境分离菌）及工程菌株的管理，不适用于高致病性病原微生物（需遵循《病原微生物实验室生物安全管理条例》特殊规定）。

3.核心原则

可追溯性：建立菌种“一人一账一码”管理体系，全程记录操作人、时间、步骤及结果；

安全性：操作符合生物安全等级要求（如BSL-1/BSL-2），配备个人防护装备（PPE）及应急处置设备；

稳定性：优先采用低温、冷冻等长期保存方法，减少传代次数，降低菌种变异风险。

二、菌种保存操作规程

1.保存前准备

（1）菌种验收与确认

接收菌种时，核对菌种名称、编号、来源（如ATCC编号、提供单位）、纯度证明（如无菌检验报告），填写《菌种接收登记表》；

对分离菌株，需通过形态学观察（如菌落形态、革兰染色）、生化反应（如API试纸条）或分子鉴定（如16SrRNA测序）确认菌种身份，确保无杂菌污染。

（2）保存材料准备

培养基：短期保存用斜面培养基（如营养琼脂、麦康凯琼脂，根据菌种营养需求选择），长期保存用冷冻保护剂（如20%-30%甘油、10%二甲基亚砜（DMSO），需灭菌备用）；

容器：斜面培养管（15×150mm，灭菌）、冷冻保存管（2mL螺口冻存管，标注菌种名称、编号、保存日期）、液氮罐（长期保存用，定期检查液氮量）。

2.保存方法与操作

（1）短期保存（1-3个月，适用于频繁使用的菌种）

斜面低温保存法：

将纯培养的菌种划线接种于无菌斜面培养基，置于适宜温度培养（如细菌37℃培养18-24h，真菌28℃培养48-72h），至菌落形态典型且无杂菌；

培养完成后，用无菌parafilm膜密封斜面管口，标注菌种名称、编号、接种日期；

置于4℃冰箱保存，每月检查一次菌落状态，若出现污染或菌落老化，立即重新传代保存。

（2）长期保存（6个月-数年，适用于长期备用或稀有菌种）

甘油冷冻保存法（-80℃冰箱）：

取对数生长期的菌液（细菌OD600≈0.6-0.8，真菌孢子悬液浓度10^6-10^8CFU/mL），与无菌甘油按7:3（菌液：甘油）比例混合，涡旋振荡均匀；

将混合液分装至无菌冻存管（每管1mL），标注信息后，先置于-20℃冰箱预冻1-2h，再转移至-80℃冰箱长期保存；

液氮保存法（-196℃，适用于珍贵菌种或工程菌株）：

按甘油冷冻法制备菌液-保护剂混合液，或直接取斜面新鲜菌落制成菌悬液（含保护剂）；

冻存管密封后，放入液氮罐提篮，缓慢降至液氮面下（避免温差过大导致管子破裂），记录保存位置（如提篮编号、层数）。

3.保存期间管理

建立《菌种保存台账》，记录菌种名称、编号、保存方法、保存位置、有效期、操作人；

定期检查：4℃冰箱每周检查一次（有无污染、培养基干涸），-80℃冰箱每月检查温度（确保≤-70℃），液氮罐每周补充液氮（液面高度不低于提篮底部）；

菌种保存有效期：短期保存每3个月传代一次，长期保存每1-2年复苏验证一次，确认纯度与活性。

三、菌种传代操作规程

1.传代原则

严格控制传代次数：标准菌株传代不超过5代（从原始菌种开始计数），分离菌株传代不超过3代，避免过度传代导致菌种变异（如毒力下降、生化特性改变）；

传代前确认菌种状态：复苏保存的菌种后，需先进行纯度检验（如划线接种平板，观察菌落均一性），无杂菌后方可传代。

2.传代操作流程

（1）复苏菌种

短期保存的斜面菌种：直接取少量典型菌落作为传代接种物；

长期保存的冷冻菌种：从-80℃冰箱或液氮罐取出冻存管，立即置于37℃水浴锅快速解冻（1-2min，避免反复冻融），取0.1-0.2mL菌液接种至适宜培养基。

（2）接种与培养

斜面传代：用无菌接种环取少量纯菌，在新鲜斜面培养基上划“Z”字或螺旋线，避免划破培养基表面；

液体传代：取菌液接种至液体培养基（如营养肉汤），置于摇床或培养箱培养（细菌37℃、180rpm培养12-16h，真菌28℃静置培养24-48h）；

培养条件需与菌种原始培养条件一致（如厌氧菌需在厌氧培养箱中操作），确保菌落/菌液形态正常。

（3）纯度验证与保存

传代培养后，通过肉眼观察（菌落形态均一、无异常颜色或黏液）、显微镜检查（革兰染色后无杂菌）确认纯度；

合格的传代菌种按“菌种保存操作规程”进行保存，填写《菌种传代记录表》，记录传代次数、日期、验证结果。

3.注意事