第17章流式细胞仪分析技术及应用.pptVIP

荧光补偿第30页，共77页，星期日，2025年，2月5日通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理第31页，共77页，星期日，2025年，2月5日细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电（一）分选基本原理第32页，共77页，星期日，2025年，2月5日分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求第33页，共77页，星期日，2025年，2月5日参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术第二节数据的显示与分析第34页，共77页，星期日，2025年，2月5日FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、参数第35页，共77页，星期日，2025年，2月5日单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置二、数据显示方式第36页，共77页，星期日，2025年，2月5日由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图第37页，共77页，星期日，2025年，2月5日单参数直方图细胞相对数量信道(channel)第38页，共77页，星期日，2025年，2月5日双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图第39页，共77页，星期日，2025年，2月5日1.双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度第40页，共77页，星期日，2025年，2月5日双参数直方图点图第41页，共77页，星期日，2025年，2月5日2.二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。第42页，共77页，星期日，2025年，2月5日二维等高图第43页，共77页，星期日，2025年，2月5日3.假三维等高图第44页，共77页，星期日，2025年，2月5日（三）三参数直方图第45页，共77页，星期日，2025年，2月5日多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析第46页，共77页，星期日，2025年，2月5日Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术第47页，共77页，星期日，2025年，2月5日A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门第48页，共77页，星期日，2025年，2月5日线性门第49页，共77页，星期日，2025年，2月5日Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。第50页，共77页，星期日，2025年，2月5日D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。第51页，共77页，星期日，2025年，2月5日样本制备标记染色液相芯片技术质量控制第四节流式细胞仪免疫分析的技术要求第52页，共77页，星期日，2025年，2月5日外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落