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动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

x0.1%的8－羟基喹啉的，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制

x异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

xβ-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。

以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：

1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。

2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活

3）立即将样品置于RNAlater?TissueCollection:RNAStabilizationSolution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（0.5cm），这样RNAlater才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。

使用正确的细胞或组织储存条件

在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。

RNAlater使样品储存更为便利。储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。有关RNAlater的更多信息请参考/techlib/resources/RNAlater.

彻底匀浆样品

细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型，哪些方法是最适合的匀浆方法，请参考/techlib/tb/tb_183.html.

在RNA提取之前预处理样品裂解液

对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖，会降低RNA的质量和产量，用PlantRNAIsolationAid预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。

选择最好的RNA分离方法

现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如RNAqueous?或RNAqueous-4PCRKit。因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如