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毕赤酵母高效表达猪γ干扰素及其蛋白活性解析

一、引言

1.1研究背景与意义

在病毒学和免疫学领域，干扰素（Interferon，IFN）作为一类具有广泛生物学活性的蛋白质，自1957年被Isaacs和Lindenmann发现以来，一直是研究的焦点。干扰素能够干扰病毒复制、调节免疫系统，在机体抗病毒防御中发挥着关键作用。其抗病毒作用主要体现在直接激活免疫细胞，间接抑制病毒的复制过程，从而控制病毒的生长和增殖，在控制病毒感染、阻止病毒在机体内扩散，以及促进病毒性疾病的痊愈等方面起到了重要作用。根据抗原特异性和作用受体的不同，干扰素被分为多种类型，其中γ干扰素较为常见且功能独特。猪γ干扰素（PoIFN-γ）是由激活的T细胞和NK细胞产生的一类细胞因子，在猪的免疫防御体系中占据着关键地位。

在养殖业中，猪病的防治一直是关乎产业发展和经济效益的重要问题。猪作为重要的家畜，其健康状况直接影响着肉类供应和养殖从业者的收益。由病毒、细菌等病原微生物侵染猪所引起的各种传染性疾病，不仅严重制约了养猪业的健康发展，还对人类健康存在着巨大隐患，如猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）等，每年都给全球养猪业造成巨大的经济损失。这些病毒感染猪后，可导致猪生长发育受阻、免疫力下降，甚至死亡。猪γ干扰素在抗病毒感染过程中，能够诱导细胞产生抗病毒蛋白，有效抑制病毒的复制和扩散，同时调节机体的免疫应答，增强免疫细胞的功能。深入研究猪γ干扰素，对于揭示猪的抗病毒免疫机制、开发新型抗病毒药物和疫苗具有重要的理论和实践意义。

传统的猪γ干扰素制备方法存在诸多限制，难以满足大规模生产和应用的需求。随着基因工程技术的飞速发展，利用基因重组技术制备猪γ干扰素成为了研究热点。毕赤酵母表达系统作为一种高效的真核表达系统，具有诸多优势。毕赤酵母是甲醇营养型酵母菌，能够将甲醇作为唯一碳源。它拥有目前最强，调控机理最严格的启动子之一醇氧化酶基因AOX1启动子，非常利于外源基因的表达调控；具有翻译后的蛋白加工修饰功能，例如磷酸化、糖基化等，是一种不可多得的集聚多种优势的真核表达系统；既可以在细胞内表达，也可在细胞外表达；培养基成本低廉，培养条件简单，生长繁殖速度迅速；外源基因可以单拷贝或者多拷贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上，伴随着染色体的复制而复制，有较高的遗传稳定性，以稳定的表达菌株存在；可以进行大规模发酵，适合高密度培养，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备。

本研究旨在利用毕赤酵母表达系统实现猪γ干扰素的高效分泌表达，并对表达产物的蛋白活性进行深入分析。这不仅有助于进一步了解猪γ干扰素的生物学功能和作用机制，为猪病的防治提供理论基础；还能够为开发安全、有效的重组猪γ干扰素制剂奠定技术基础，有望为养猪业提供新的疫病防控手段，具有重要的经济价值和社会意义。

1.2国内外研究现状

国内外对于猪γ干扰素的研究涵盖了基因克隆、表达系统以及蛋白活性等多个方面。在基因克隆领域，1990年，Dijkmans等首次克隆出猪IFN-γ基因，此后，众多学者对不同猪种的IFN-γ基因进行了克隆与分析。李富强等人从合作猪脾脏组织中克隆出IFN-γcDNAORF全长501bp，共编码166个氨基酸，N端具有由23个氨基酸组成的信号肽，该蛋白预测的分子质量为19.4185kDa，等电点为9.54，还发现了其核苷酸序列上的磷酸化位点和N-糖基化位点。周希萌对广西巴马小型猪和贵州小型猪的γ干扰素基因进行克隆，测序结果表明，与Vandenbroeck等报道的猪INF-γcDNA的同源性为100％，与其他猪种的INF-γcDNA也具有较高同源性。

在表达系统方面，大肠杆菌和毕赤酵母是常用的表达宿主。王丽等人选择大肠杆菌偏爱密码子人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因，克隆至原核表达载体pQE30中，IPTG诱导表达，目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达，表达量占总菌体蛋白的84.5％，纯化后的纯度达到95％以上，在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6.2×10^5／mg。黄志清将去除信号肽的猪干扰素-γcDNA基因置于毕赤酵母a因子分泌信号的DNA序列后，构建成能精确分泌表达PoIFN-γ蛋白的重组表达载体pPIC9K-α-PoIFN-γ，通过电转化导入毕赤酵母GS115中，获得了能够高效分泌表达PoIFN-γ的多拷贝插入重组子，表达量分别为105mg/L和108mg/L，约占培养液总蛋白的6.0％。李路宁构建了重组表达载体pPIC9K-PoIFN-γ并导