第5章 表达载体.pptVIP

第5章表达载体第1页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。1、表达元件(expressionelements)：1）启动子(promoter)：三类，即lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。T7噬菌体启动子λ噬菌体的PL启动子。第一节大肠杆菌表达载体第2页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*2）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环结构而终止）。3）核糖体结合位点(ribosomebindingside,RBS)：Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要，一般3-11bp。2、表达形式完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。融合蛋白(fusionprotein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。第3页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*3、表达的控制诱导表达系统：IPTG防渗漏表达系统：lacIqPL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。二、利用T7噬菌体启动子的表达载体pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚合酶识别，可用IPTG诱导表达。第4页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*非融合型表达载体主要元件：强启动子、SD、起始密码子ATG、万能终止密码子。PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因第5页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI第6页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*三、表达融合蛋白的表达载体1、GST(glutahioneS-transferase,谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：如Amershamm公司的pGEX系列，其GST来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签和Xa因子酶工位点，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理可得到纯的目的蛋白。第7页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*3、内含肽表达载体：如NEB公司的Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽(signalpeptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。第8页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因第9页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3’或5’端，但必须维持正确的ORF。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体第10页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列DNA序列第11页，共25页，星期日，2025年，2月5日西南大学生物技术专业基因工程*位相载