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DB34T8212008动物组织中氯霉素的残留测定酶联免疫吸附法

本标准规定了动物组织中氯霉素残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪、牛、羊、鸡等动物肌肉组织中氯霉素残留量的测定。

本方法的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。当样品中氯霉素残留量在0.3~10.0μg/kg范围内时，方法回收率为70%~120%，相对标准偏差小于15%。

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，曾广泛应用于畜禽养殖业。但由于其可能引起人体再生障碍性贫血等严重不良反应，许多国家已禁止在食用动物中使用氯霉素。因此，建立快速、准确、灵敏的氯霉素残留检测方法对保障食品安全具有重要意义。

酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）是基于抗原抗体特异性反应的检测技术，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、适合批量样品检测等优点，已成为氯霉素残留筛查的重要手段。

2原理

本方法基于竞争性酶联免疫吸附原理。样品中残留的氯霉素与酶标抗原竞争结合包被在微孔板上的特异性抗体，加入底物溶液后，酶催化底物显色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。样品中氯霉素浓度与吸光度值成反比，通过标准曲线可定量计算出样品中氯霉素的含量。

3试剂和材料

3.1试剂

除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。

3.1.1乙腈：色谱纯。

3.1.2正己烷：色谱纯。

3.1.3氯霉素标准品：纯度≥98%。

3.1.4氯霉素酶标抗原：20℃保存，有效期6个月。

3.1.5氯霉素抗体：20℃保存，有效期6个月。

3.1.6包被缓冲液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）。

3.1.7洗涤液：含0.05%Tween20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。

3.1.8封闭液：含1%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。

3.1.9底物溶液：3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）溶液。

3.1.10终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2标准溶液配制

3.2.1氯霉素标准储备液（1mg/mL）：准确称取10.0mg氯霉素标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，20℃保存，有效期3个月。

3.2.2氯霉素标准工作液：用磷酸盐缓冲液将标准储备液稀释成0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μg/mL系列浓度，现用现配。

3.3材料

3.3.1酶标板：96孔可拆微孔板。

3.3.2微量移液器：10~100μL、20~200μL、100~1000μL。

3.3.3涡旋混合器。

3.3.4离心机：转速≥4000r/min。

3.3.5氮吹仪。

3.3.6酶标仪：配备450nm滤光片。

3.3.7分析天平：感量0.0001g。

3.3.8pH计：精度±0.01。

4样品前处理

4.1样品制备

取动物组织样品，去除脂肪和结缔组织，剪碎后用组织捣碎机均质，置于20℃冷冻保存备用。

4.2提取

准确称取5.0g（精确至0.01g）均质样品于50mL离心管中，加入10mL乙腈，涡旋混合2min，以4000r/min离心10min。取上清液于另一离心管中，残渣用10mL乙腈重复提取一次，合并上清液。

4.3净化

将上清液转移至分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇2min，静置分层后弃去正己烷层。将乙腈层转移至洁净离心管中，于40℃水浴中氮吹至近干。用1mL磷酸盐缓冲液溶解残留物，涡旋混合1min，作为待测液。

5测定步骤

5.1包被

用包被缓冲液将氯霉素抗体稀释至工作浓度，每孔加入100μL，37℃孵育2h。弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

5.2封闭

每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h。弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

5.3加样

每孔加入50μL标准工作液或待测液，再加入50μL氯霉素酶标抗原，混匀后37℃孵育1h。弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次，每次3min。

5.4显色

每孔加入100μL底物溶液，室温避光显色15min。

5.5终止

每孔加入50μL终止液，轻轻混匀。

5.6测定

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度值。

6结果计算

6.1标准曲线绘制

以标准溶液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

6.2样品含量计算

将样品待测液的吸光度值代入标准曲线回归方程，计算出样品中氯霉素的含量，按公式（1）计算样品中氯霉素的残留量：

X=(C×V)/m

式中：

X——样品中氯霉素残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——从标准曲线上查得的待测液中氯霉素浓度，单位为微克每升（μg/L）；