蛋白质定量分析.pptVIP

第1页，共21页，星期日，2025年，2月5日定性分析定量分析有没有是不是有多少第2页，共21页，星期日，2025年，2月5日内容BCA法测定蛋白质含量蛋白质定量分析的方法操作注意事项思考讨论第3页，共21页，星期日，2025年，2月5日BCA法测定蛋白质含量2.掌握分光光度计的使用。实验目的1.掌握BCA法测定血清蛋白质浓度的原理。第4页，共21页，星期日，2025年，2月5日BCA分子式BCA试剂盒实验原理BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）第5页，共21页，星期日，2025年，2月5日实验原理紫蓝色562nm第6页，共21页，星期日，2025年，2月5日实验步骤（一）实验材料1、器材721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管2、试剂（1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。（4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。（5）待测样品。第7页，共21页，星期日，2025年，2月5日表1BCA法测定蛋白质含量管号试剂（mL）空白管12345测定管标准蛋白溶液（0.3mg/ml）—0.10.20.30.40.5—蒸馏水0.50.40.30.20.1——待测样品——————0.5BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量g306090120150数据有改动ug第8页，共21页，星期日，2025年，2月5日1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。 （二）实验操作C=MV——×250第9页，共21页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定量分析的方法紫外线吸收法改良微量凯式定氮法双缩脲法Folin-酚试剂法考马斯亮蓝结合法BCA法280nm16%第10页，共21页，星期日，2025年，2月5日方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响第11页，共21页，星期日，2025年，2月5日BCA法的特点1、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好3、抗试剂干扰能力较强4、经济实用第12页，共21页，星期日，2025年，2月5日注意事项1、实验分组2、准确量取试剂，吸管残余液体要吹出。3、平行加样，物归原位。4、正确使用分光光度计，比色杯不润洗。5、正确绘制标准曲线，标注名称、姓名、仪器型号、作图时间。6、实验结果书写规范，三线表。第13页，共21页，星期日，2025年，2月5日可见光分光光度计的操作步骤：1）预热仪器。2）选定波长。3）固定灵敏度档。一般