第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备.pptVIP

特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法第29页，共82页，星期日，2025年，2月5日效率最高价格昂贵FACS第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮?“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日第二节单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统?单抗含量不高，牛血清Ab难以去除第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日腹腔注射法第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日前5天进行,预先腹腔注射pristane（1～5）×106细胞1～3w形成腹水高滴度腹水第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）二、 单克隆抗体的纯化第37页，共82页，星期日，2025年，2月5日ELISA第38页，共82页，星期日，2025年，2月5日ELISA第39页，共82页，星期日，2025年，2月5日多头加样枪第40页，共82页，星期日，2025年，2月5日。免疫荧光法第41页，共82页，星期日，2025年，2月5日盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化第42页，共82页，星期日，2025年，2月5日Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示?表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 单克隆抗体的性质鉴定第43页，共82页，星期日，2025年，2月5日四、单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性第44页，共82页，星期日，2025年，2月5日优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高第45页，共82页，星期日，2025年，2月5日McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较第46页，共82页，星期日，2025年，2月5日McAbandPcAb第47页，共82页，星期日，2025年，2月5日第三节基因工程抗体制备基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。第48页，共82页，星期