（69页PPT）质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定.pptVIP

菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。溶液Ⅱ在低时可能出现浑浊，置于37℃保直至溶解为清亮的溶液。问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因对策常见问题混有蛋白混有RNA混有基因组DNA不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质加入RNaseA室一段时间加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因对策常见问题紫外光吸收法定量检测原理：1.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2.物质对光的吸收是具有选择性的3.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.计算方法因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链DNA)1OD260=50μg/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33μg/mlRNA1OD260=40μg/ml实验方法1.记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒DNA(?g/ml)=50×(OD260)×稀释倍数(2微升稀释至100微升)注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280）Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求Ratio＞1.9RNA污染Ratio＜1.6有蛋白质或其它杂质的污染实验方法实验仪器核酸蛋白检测仪(EppendorfBioPhotometerplus)比色杯数据处理测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值定量检测第三部分酶切鉴定

DNARestrictionEnzymeDigestion限制性内切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶★平末端

在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性内切酶★3’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性内切酶5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性内切酶双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；限制性内切酶Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应