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CryIAC-cmgI融合基因的构建、原核表达及功能探究

一、引言

1.1研究背景与意义

在农业生产中，害虫侵袭和环境胁迫严重影响作物的产量与质量，对全球粮食安全构成挑战。基因工程技术为作物保护和抗逆性改良提供了新的策略，其中融合基因的构建与表达成为研究热点。

cryIAC基因源自苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis），其所编码的CryIAC蛋白是一种重要的杀虫晶体蛋白，在害虫防治领域发挥着关键作用。该蛋白能够特异性地与鳞翅目害虫肠道上皮细胞表面的受体结合，形成离子通道，破坏细胞的渗透压平衡，导致细胞裂解，进而使害虫死亡。多年来，转cryIAC基因作物，如抗虫棉等，在全球范围内广泛种植，显著减少了化学农药的使用量，降低了生产成本，同时减少了化学农药对环境的污染，保护了生态平衡。然而，随着cryIAC基因的长期广泛应用，部分害虫已逐渐对其产生抗性，这严重威胁到转cryIAC基因作物的可持续应用。

cmgI基因是从植物中分离得到的与抗逆相关的基因，其表达产物参与植物对多种逆境胁迫的响应机制。在干旱胁迫下，cmgI基因的表达上调，通过调节植物体内的渗透调节物质含量，如脯氨酸、甜菜碱等，维持细胞的膨压，保证植物正常的生理功能；在低温胁迫时，cmgI基因能够调控植物细胞膜的流动性和稳定性，减少低温对细胞的损伤；此外，cmgI基因还参与植物对病原菌侵染的防御反应，通过激活植物的免疫系统，增强植物的抗病能力。研究表明，过表达cmgI基因的植物在多种逆境条件下表现出更强的适应性和耐受性，为作物抗逆性改良提供了重要的基因资源。

将cryIAC和cmgI基因构建成融合基因并进行原核表达，有望结合两者的优势，为农业生产带来新的突破。一方面，融合基因表达产物可能兼具杀虫和抗逆特性，拓宽作物的保护范围，提高作物在复杂环境下的生存能力，减少因害虫侵害和环境胁迫导致的产量损失；另一方面，通过融合基因的表达，可能延缓害虫对cryIAC蛋白的抗性发展，延长抗虫基因的使用寿命。此外，对融合基因的研究有助于深入理解基因功能和表达调控机制，为基因工程在农业领域的进一步应用提供理论基础和技术支持。

1.2研究目的与内容

本研究旨在构建cryIAC-cmgI融合基因，并实现其在原核系统中的高效表达，为后续开发具有多重抗性的转基因作物奠定基础。具体研究内容如下：

基因克隆：从苏云金芽孢杆菌和相关植物基因组中分别克隆cryIAC和cmgI基因，通过PCR技术扩增目的基因片段，并对其进行测序验证，确保基因序列的准确性。

载体构建：选择合适的原核表达载体，利用限制性内切酶和DNA连接酶将cryIAC和cmgI基因依次连接到表达载体上，构建重组表达载体。通过酶切鉴定和测序分析，验证载体构建的正确性。

原核表达：将重组表达载体转化到大肠杆菌等原核宿主细胞中，利用IPTG等诱导剂诱导融合基因的表达。优化诱导表达条件，如诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等，以提高融合蛋白的表达量。

表达产物分析：采用SDS-PAGE、Westernblot等技术对融合蛋白的表达情况进行分析，确定融合蛋白的分子量和表达水平；通过活性测定实验，检测融合蛋白的杀虫活性和抗逆相关活性，评估融合基因表达产物的功能。

1.3研究方法与技术路线

本研究综合运用多种分子生物学技术，具体如下：

PCR技术：用于扩增cryIAC和cmgI基因，根据已知的基因序列设计特异性引物，通过PCR反应获得大量的目的基因片段。

酶切连接技术：利用限制性内切酶对目的基因和表达载体进行切割，产生互补的粘性末端或平末端，然后用DNA连接酶将两者连接起来，构建重组表达载体。

转化技术：采用化学转化法或电转化法将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞中，使其获得外源基因并表达。

诱导表达技术：在大肠杆菌培养过程中，添加IPTG等诱导剂，激活重组表达载体上的启动子，诱导融合基因的表达。

SDS-PAGE技术：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离融合蛋白，根据蛋白分子量标准确定融合蛋白的大小，并通过染色方法观察蛋白的表达情况。

Westernblot技术：利用特异性抗体与融合蛋白结合，通过化学发光或显色反应检测融合蛋白的表达，进一步验证融合蛋白的正确性和表达量。

技术路线如图1-1所示：

首先提取苏云金芽孢杆菌和植物基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，分别得到cryIAC和cmgI基因片段；对扩增产物进行测序验证后，将其与原核表达载体进行双酶切，然后连接构建重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆；对阳性克隆进行IPTG诱导表达，收集菌体进行