课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能.pptVIP

激光扫描共聚焦显微镜

（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）

;;它和荧光显微镜的关系？

它和电子显微镜的关系？

观察的信号如何而来？;激光共聚焦显微镜的原理;泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物品之影像放大,而能被观察的工具。;;共聚焦显微镜成像;激光扫描共聚焦显微镜

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM;荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

激发光源;荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

光学原理;;荧光显微镜系统;普通荧光显微镜;激光共聚焦

PMT检测器—伪彩色

灵敏度高

光信号-电信号-图像

由计算机精确控制图像的合成和输出，同时电信号增加放大倍数。

多通道荧光采集

一般3个荧光通道和一个透射光通道，分别成像;荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

基于的平台—获取图像方式;--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。;激光扫描共聚焦显微镜的优缺点;1957年，MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理

1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面

1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世

1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟

1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜

;;激光共聚焦显微镜构成;ZeissLSM-510ConfocalSystem

;ZeissLSM-710ConfocalSystem

;激光共聚焦显微镜的功能;激光共聚焦显微镜的功能;薄层光学切片;牛肺上皮细胞

;ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon;小鼠神经元细胞

;多通道同时扫描;;多重荧光标记;绿色：SYBR14染色，活精子

红色：PI染色，死精子;拟南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia;ZOOM成像;;;多维度扫描;;胚胎的结构;单层面扫描多层叠加;耳蜗基底膜;三维图像重建;三维图像重建;;荧光定量分析;荧光定量分析;荧光表达量测定;;激光共聚焦显微镜技术应用;;;/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/fluorescence-microscopy-and-immunofluorescence-if/organelle-stains-for-fluorescence-imaging-selection-guide.html;绿色荧光蛋白

（Green-FluorescentProtein，GFP）;ThesefusionproteinsemployarangeoffluorescentmoleculesincludingCFP,GFP,mKATE2,RFPandYFP。;荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。;荧光探针的选择;荧光探针的选择—多重荧光标记;1.作为亚细胞定位的标记;2.作为整体结构的标记;荧光探针的选择—多重荧光标记;样品前处理

组织切片：切片的厚度4-50mm

①冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。

②石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。

细胞标本：

①细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。

②细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于20％；

如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的80％。

③承载细胞的器皿：

petri皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。

盖玻片：适用于固定的细胞。;样品制备的基本原则;样品制备的基本原则;样品的阴性对照：病变组与非病变组;样品制备的基本原则;;谢谢大家！