枸杞实时荧光定量RT-qPCR内参基因筛选与验证.pdfVIP

江苏农业科学２０２３年第５１卷第９期—４１—

李浩霞，黄稳娥，柳西宁，等．枸杞实时荧光定量ＲＴ－ｑＰＣＲ内参基因筛选与验证［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（９）：４１－５１．

ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．０９．００６

枸杞实时荧光定量ＲＴ－ｑＰＣＲ内参基因筛选与验证

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李浩霞，黄稳娥，柳西宁，朱馨蕾，任晓月，安巍，周军，赵建华

（１．宁夏农林科学院林业与草地生态研究所，宁夏银川７５０００２；２．宁夏农林科学院枸杞科学研究所／

国家枸杞工程技术研究中心，宁夏银川７５０００２；３．北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川７５００２１）

摘要：以９种不同基因型枸杞的不同组织（茎、叶、花、果）和不同发育期（ＦＳ～ＦＳ）的果实为试材，选取Ａｃｔ－１／

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Ａｃｔ－３、Ｅｆ１ａ、Ｇａｐｄｈ、Ｈ３ｂ、Ａｃｘ４、Ｐｐ２ａ、Ｒｈ３７、Ｓａｍｃ、Ｔｕｂ为候选内参基因，利用实时荧光定量技术（ＲＴ－ｑＰＣＲ）检测了９

个候选基因在不同基因型枸杞的不同组织和不同发育阶段果实中的表达水平。并采用ｇｅＮｏｒｍ、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ、

ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ、ＤｅｌｔａＣｔ、ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ分析方法，评估候选内参基因的表达稳定性，并选择Ｂｅａｔ基因验证内参基因。结果表

明，Ｅｆ１ａ为不同基因型枸杞的不同组织和５个发育时期果实中表达较稳定的内参基因，Ｇａｐｄｈ为表达最不稳定的内参

基因；在宁夏枸杞中表达最稳定的内参基因为Ｒｈ３７，其次为Ｅｆ１ａ。进一步采用Ｂｅａｔ基因对不同基因型枸杞的不同组

织（茎、叶、花、果）和５个发育时期果实中的表达模式进行验证，表明Ｅｆ１ａ、Ａｃｔ－１基因可作为枸杞稳定的内参基因。

关键词：枸杞；内参基因；实时荧光定量ＰＣＲ；定量分析

＋

中图分类号：Ｓ５６７．１９０．１文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０２３）０９－００４１－１１

枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ）是茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）枸杞属研究较少，仅有少量枸杞基因功能和基因表达模式

（ＬｙｃｉｕｍＬｉｎｎ．）多年生植物，具有抗旱、抗寒、耐盐分析的报道。关于枸杞内参基因筛选的报道的研

碱等特性，是改良土壤的先锋树种［１－３］。我国枸杞究材料多用黑果和宁杞１号［１６－１８］。目前尚未见有

资源较为丰富。近年来，宁夏农林科学院收集有国关不同基因型枸杞内参基因筛选的报道。

内外枸杞属１０个种、３个变种以及特异性种质资源实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

２０００余份，活体保存２００００余株［４－５］。宁夏枸杞ＰＣＲ，ＲＴ－ｑＰＣＲ）技术是在ＰＣＲ反应体系中加入荧

（ＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍＬ．）是我国药典收录的唯一枸杞光作为荧光探针，实时监测ＰＣＲ反应进程荧光信号

［６］积累，并通过制作标准曲线计算待测样本相对表达

属植物。研究表明，枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜

［１９］

素、黄酮等是枸杞子中重要的功效物质，具有促进量的一种技术。它具有灵敏度高、重复性好、可

免疫、降低血糖、抗氧化、延缓衰老等生物活性［７－９］。检测大量样本且比常规ＲＴ－ＰＣＲ检出率高等优

近年来从枸杞子中分离鉴定出枸杞亚精胺Ａ－Ｏ，势［２０－２１］，广泛应用于基因表达水平的分析。但在试

是一种具有抗阿尔茨海默病、抗氧化、抗衰老和神验操作过程中，ＲＮＡ的质量和浓度、ｃＤＮＡ的逆转录

经保护作用的生物活性成分［１０－１２］。目前，枸杞的研过程、ＰＣＲ的扩增程序和