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抗菌肽PekⅡ基因于大肠杆菌的融合表达及纯化探究

一、引言

1.1研究背景

抗菌肽（AntimicrobialPeptides）作为生物先天免疫的关键防御物质，在生物的免疫防御体系中占据着举足轻重的地位。它是一类具有抗菌活性的短肽，由基因编码产生，广泛存在于从原核生物到真核生物的各种生物体中。其分子量通常较小，一般在4000Da左右，肽链由几十个氨基酸残基组成。抗菌肽具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）、霉菌、螺旋体以及病毒（如流感病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒）等多种病原体均表现出强大的杀伤活性。此外，它还具备抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等多种生物活性。更为重要的是，抗菌肽不易使病原体产生抗药性，这一特性使其在解决日益严峻的抗生素耐药性问题上展现出巨大的潜力，在医疗、食品、农业等众多领域具有广阔的应用前景。在医疗领域，它有望成为治疗各种感染性疾病的新型药物；在食品工业中，可用于食品防腐保鲜，提高食品安全性；在农业方面，能用于植物病虫害防治，减少化学农药的使用，提高农作物产量和品质。然而，目前对于许多抗菌肽的研究还不够深入，其基因表达和大规模生产技术仍有待完善，这限制了它们的实际应用。PekⅡ基因作为一种具有独特抗菌特性的基因，对其进行深入研究，实现其在大肠杆菌中的高效融合表达及初步纯化，对于进一步挖掘抗菌肽的应用价值，推动相关领域的发展具有重要意义。

1.2抗菌肽PekⅡ基因概述

PekⅡ基因是人工设计合成的一种杂合肽基因，它以pleurocidin成熟肽N端23-30位氨基酸和misgurin成熟肽N端7-21位氨基酸杂合成的23肽为基础，通过选用大肠杆菌偏好密码子人工设计并合成。这种独特的氨基酸组成赋予了PekⅡ基因编码的抗菌肽独特的结构特点和生物学活性。从结构上看，PekⅡ抗菌肽具有特定的氨基酸序列和空间构象，这些结构特征与其抗菌活性密切相关。其抗菌机制主要是通过与细菌细胞膜相互作用，破坏细胞膜的完整性，导致细胞内物质泄漏，从而达到杀菌的目的。具体来说，PekⅡ抗菌肽带有的正电荷使其能够与细菌细胞膜表面带负电荷的磷脂等成分相互吸引，随后抗菌肽插入细胞膜，形成跨膜通道或孔洞，破坏细胞膜的正常功能，最终导致细菌死亡。研究PekⅡ基因在大肠杆菌中的表达，对于深入了解其抗菌机制、优化抗菌肽性能以及开发新型抗菌药物具有重要意义。大肠杆菌作为一种常用的表达宿主，具有生长迅速、培养成本低、遗传背景清楚等优点，通过在大肠杆菌中表达PekⅡ基因，可以高效地获得大量的PekⅡ抗菌肽，为后续的研究和应用提供充足的材料。

1.3大肠杆菌表达系统

1.3.1大肠杆菌表达系统优势

大肠杆菌表达系统是目前基因表达技术中应用最为广泛的经典表达系统之一。其具有诸多显著优势，首先是高表达水平，大肠杆菌细胞拥有强大的代谢能力和丰富的细胞机制，能够高效地合成和折叠蛋白质，从而实现高水平的目标蛋白表达。其次，该系统操作简单便捷，大肠杆菌的培养和维护相对容易，只需简单的培养基和培养条件即可生长繁殖，这使得实验操作易于掌握。同时，成本低廉也是其一大突出优势，与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统在菌株培养、表达载体构建以及蛋白表达过程中所需的成本较低，适合快速大规模生产，能够满足工业化生产对成本控制的要求。再者，大肠杆菌表达系统具有良好的可调控性，通过选择合适的启动子和诱导剂，研究人员能够根据需要灵活地调控目标基因的表达水平和表达时间，如常用的IPTG诱导表达系统，能够精确地控制蛋白的表达时机和表达量。此外，大肠杆菌具有丰富的基因组信息和先进的遗传工程技术，便于遗传操作，研究人员可以通过各种遗传手段对其进行改造，增强表达性能、改善折叠能力等，以提高目标蛋白的表达水平和纯度。同时，大肠杆菌还拥有多样化的宿主菌株，可适用于不同表达需求和表达策略，为科研工作者提供了更多的选择。

1.3.2大肠杆菌表达系统不足

尽管大肠杆菌表达系统具有众多优势，但在实际应用中也存在一些不足之处。一方面，大肠杆菌是原核生物，缺乏真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工系统，如糖基化修饰、磷酸化修饰、二硫键氧化形成等。这些修饰对于许多蛋白质的结构和功能至关重要，缺乏相应修饰可能导致表达的蛋白质不具有天然的活性和稳定性，影响其后续的应用。另一方面，在大肠杆菌中表达的蛋白质多以包含体形式存在。包含体是一种无活性的蛋白质聚集体，其形成原因主要是大肠杆菌缺乏辅助蛋白质折叠机制，重组蛋白质在原核表达体系表达过程中通常以一种自发折叠的方式形成特定结构，对于部分结构复杂、疏水性强的蛋白质易于导致错误折叠，最终形成无活性的包涵体。此外，大肠杆菌自身的内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造