肿瘤细胞培养和杂交瘤技术.pptVIP

肿瘤细胞培养和杂交瘤技术;（优选）肿瘤细胞培养和杂交瘤技术;;癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在体内或体外一样具有无控制生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养建细胞系。如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的Hela细胞系。;;癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后者为相反）。;;体内细胞处于不同状态，大概分成三种命运:

①继续增殖细胞，不断离开G1期通过细胞周期中不同时期（S、G2、M）完成细胞分裂，如骨髓干细胞，胃肠上皮中的基底细胞等，

②不增殖细胞，这类细胞在分裂完成后，暂处于G1期，正常情况下不合成DNA，不进入细胞分裂期，如肝细胞，只有受损或切除时肝细胞再分裂增殖。哺乳动物的初级卵细胞也属于此类。

③不增殖细胞，这类细胞由R点走向分化细胞，并执行专门功能的细胞（称终末细胞）如神经细胞、哺乳动物成熟的红细胞、皮肤上皮的角质细胞、多性核粒细胞。;肿瘤和正常的组织同样在体内也具有三种不同的细胞群：

①增殖细胞群（A）：是肿瘤中处于增殖周期的细胞，与肿瘤生长直接有关，亦是化学疗法最易攻击的部分。

;;;ml细胞悬液），计算活细胞平均数，连续7天。

转移各标本到另一平皿中，用无菌小型刀剪从肿瘤组织切下外层（细胞活性好）癌块，放于另一无菌平皿中。

而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。

五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定

HITES选择培养基，加有氢化可的松（hydrocordisone）、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(tramsferrin)、雌激素(estradiol)、硒(selenium)等成分。

这样的大小和重量时足以致病人于死亡。

2、克隆效应（cloningefficiency）

秋水仙素能与微管蛋白强烈结合，引起微管解体，纺锤体破坏，结果染色体的移动被阻断，细胞分裂停留在中期，它是属于M期的特异性药物。

HEPES缓冲液，10×CaHEPES，2×CaHEPES磷酸缓冲液，NaAc,Tris-EDTA缓冲液，无水乙醇，Eagle’sMEM/15%FCS，G418。

可见到清晰的每条染色体和上面的分带。

而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。

精心传代、换液、避免污染，需经半年以上的细胞培养，方能够达到建立细胞系的目的。

为了制备准确的细胞生长曲线，接种的细胞数要合适，对于癌细胞和转化细胞，通常接种3X104/ml细胞。

04%EDTA，含盖玻片的培养皿，血球计数器，固定细胞，冷醋酸甲醇（acetic:methanol为1：3,ice-cold）新鲜制备，去离子水，放射自显影，乳胶，曝光盒。

⑤证明外源基因有无表达。;;;;;当前较有前景的靶向治疗;当前较有前景的靶向治疗;②制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子EGF受体EGFR和HER-2。80年代研究人员发现，在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在的靶向性疗法，它没有毒副作用，不会杀死正常细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种治疗晚期乳腺癌的药物Herceptin，并于1998年获准上市。Herceptin是一种单克隆抗体药物，靶向HER-2，这种药物能使只有5个月寿命的晚期乳腺癌病人继续生存。为什么Herceptin成功获准，由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅）的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。

;Astrazeneca公司的肺癌药Iressa等都是靶向药物，靶EGFR，但成功的只有Herceptin。Iressa只在10℅肺癌患者中有神奇作用，但在大规模的临床试验中90℅人无效。花3亿美元，10年时间，未获批准。;;;二、癌细胞系的建立;;（一）癌细胞原代培养;1．标本收集和取材;;;2．分散癌组织;胰蛋白酶(trypsin)是最常应用的酶，但它对结缔组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿瘤，并且trypsin对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。胶原酶消化癌组织证明更有效，可抑制结缔组织细胞的生长。

胶原酶的消化方法：0.5mg／ml胶原酶处理，可在显微镜下观察，纤维细胞逐渐被除去为止。用Hanks液或培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种和培养。;;3．接种肿瘤细胞;4．成纤维细胞过度生长

的去除;;;5．培养基;血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用