E7修饰表面与微载体的构建及其骨髓间充质干细胞体外扩增和干性维持性能研究.pdfVIP

摘要

间充质干细胞（MSCs）具有自我更新、多向分化能力和低免疫原性等优点，

是组织工程和再生医学领域的重要种子细胞，其体外高效、安全扩增是实现其应

用的前提和基础。现阶段，干细胞体外扩增面临的主要问题在于，多次传代培养

易导致细胞衰老并逐渐丧失多向分化能力，即丢失干性。

在MSCs扩增数量和质量的双重要求中，干性作为扩增质控的核心指标，已

经引起了广泛的关注。研究人员发现材料的机械模量、表面拓扑形貌、化学修饰

（电荷、基团、黏附因子）等诸多因素均会对干细胞干性造成影响。尽管对干性

的内在调控机制仍存有争议，文献已证实细胞铺展面积、长径比、几何形状等黏

附行为与干细胞干性之间存在一定的联系。而常用于调节细胞黏附行为的粘连蛋

白、RGD等黏附因子不仅缺乏细胞特异性，还存在诱导MSCs提前分化的风险。

在此基础上，本文筛选了一种对骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有特异性亲和能

力的多肽EPLQLKM（E7），并引入聚乙二醇（PEG）作为连接分子，其非特异

性阻粘性可以有效地避免培养基中血清蛋白等异种蛋白的吸附带来的免疫与致

病隐患。通过巯基和马来酰亚胺的点击反应，将E7密度可控地接枝到经PEG预

修饰的玻璃基底上，探索E7修饰基底对BMSCs黏附行为与维持干性性能的影

响。X射线光电子能谱和椭圆偏振光谱仪结果证实PEG和E7的有效接枝。酸性

橙测试表明E7的实际接枝密度随着反应浓度的增加而提高。细胞粘附实验发现，

E7修饰可以提高BMSCs的黏附率与铺展面积，有效地改善细胞在表面的黏附性

能。逆转录-聚合酶链式反应、免疫荧光染色、增殖能力、三向诱导分化测试的综

合结果表明，随着E7接枝密度的增加，BMSCs干性得到更好的保持。在具有最

高接枝密度的E7修饰基底上，扩增7天后的细胞表现出高水平的干性相关标志

物表达、优良的增殖能力和成脂、成骨、成软骨三向分化能力。

基于建立的E7可控修饰技术和探明的E7对BMSCs干性的促进作用，本文

进一步设计并构建了一种新型的E7修饰明胶微载体，以满足扩增数量和质量的

双重要求。通过调节乳化过程中的明胶浓度、搅拌速度、乳化剂加入量等因素，

针对BMSCs制备了具有合适粒径分布的明胶微球。然后，通过点击反应依次修

饰PEG和E7，构建具有合适密度的E7修饰明胶微载体。扫描电子显微镜表明

E7修饰明胶微载体球型完整，表面光滑。联合能量弥散X射线探测器证实PEG

和E7的有效接枝。茚三酮测试进一步证实E7的实际接枝量随着反应浓度的增

加而提高。细胞粘附与增殖实验结果表明，E7可以改善细胞粘附，并提高扩增

数量。综合免疫荧光染色、凋亡测试、三向诱导分化的实验结果，发现在具有最

高E7接枝密度的明胶微载体上，BMSCs表现出高水平的干性标志物、低细胞凋

亡率和强大的三向分化能力。因此，本文设计并构建的E7修饰明胶微载体可以

有效地提高BMSCs的扩增效率，切实提高扩增的细胞数量和质量。这一新型扩

增微载体有望应用到BMSCs的体外规模化扩增中，改善BMSCs作为种子细胞

在组织修复和再生医疗的临床表现。

关键词：E7多肽，间充质干细胞，体外扩增，黏附，干性维持

Abstract

Duetotheuniquecharacteristics,suchasself-renewalability,multilineage

differentiationpotentialandminorimmunogenicity,mesenchymalstemcells(MSCs)

areofconsiderablevalueinregenerativemedicineandplayanimportantroleinclinical

applications.Currently,asthequantityofisolatedMSCsislimited,itisnecessaryto

developexpansiontechnologywithhighefficiency.Moreover,MSCsmayundergo

replicativesene