RNA甲基化酶METTL14介导lnc-LSG1+m6A修饰抑制肾透明细胞癌转移的作用及机制研究.pdfVIP

RNA甲基化酶METTL14介导lnc-LSG1m6A修饰抑制肾透

明细胞癌转移的机制研究

浙江大学医学院微创医学

博士研究生沈丹阳

导师李恭会

中文摘要

背景：

肾细胞癌起源于肾实质泌尿小管上皮系统，在所有成人恶性肿瘤中占比超4%，

是常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率在所有恶性肿瘤中列于第八位。肾透明细胞癌

约占所有肾细胞癌的90%，起病隐匿，无典型的临床表现，近年来虽然早期诊断比

率有所提高，但仍有近20%患者在诊断时已发生转移，失去手术机会。而许多最初

能进行手术切除的患者最后复发。肾透明细胞癌对放化疗均不敏感，转移性肾透明

细胞癌主要依赖免疫治疗和分子靶向治疗，但治疗效果仍不理想，年生存率不足

20%。转移性肾癌是目前肾透明细胞癌治疗中的难点，深入研究肾癌转移的机制

6

有望为转移性肾癌的治疗提供新的思路。N6-甲基腺嘌呤(N-methyladenosine，mA)

6

修饰是高等生物RNA上最为普遍的修饰。mA修饰在细胞内是一个动态可逆的过

程，主要受甲基转移酶(METTL3，METTL14，WTAP等)、去甲基化酶(FTO，ALKBH5

6

等)及一些mA识别蛋白（YTHDF1/2/3，YTHDC1/2，IGF2BP1/2/3等）共同调控。

近来研究显示m6A修饰在肿瘤发生和进展中的作用研究已成为目前肿瘤学研究中

的热点问题。

目的：

通过MeRIP测序（methylatedRNAimmunoprecipitationsequencing）以及一系

6

列体内和体外实验，阐明METTL14通过mA修饰对于肾透明细胞癌进展的调控作

用以及具体机制。

方法：

6

为了探索mA修饰在肾透明细胞癌进展中的潜在影响，我们首先通过qPCR，

6

Westernblot和免疫组化检测了肾透明细胞癌的癌和癌旁组织中mA修饰通路相关

分子的表达水平。接着我们通过细胞增殖实验、侵袭转移实验和划痕实验、肾原位

癌模型和肺转移模型研究了METTL14对肾透明细胞癌发生发展的影响。然后我们

利用MeRIP测序寻找METTL14的生理底物，经过RNA-IP，侵袭转移实验的进一

步验证，最终明确了长链非编码RNA，lnc-LSG1，作为METTL14的下游靶基因。

为了研究lnc-LSG1的具体作用机制，我们首先通过FISH（fluorescenceinsitu

hybridization）实验明确lnc-LSG1在细胞中的定位，在线数据库catRAPID预测发现

lnc-LSG1可能和上皮剪接调控蛋白2（ESRP2）蛋白发生结合。最后，我们进一步

运用RNA-pulldown、RNA-IP、RT-qPCR、westernblot实验阐明了lnc-LSG1对ESRP2

蛋白的调控机制，以及METTL14影响lnc-LSG1和ESRP2的具体机制。

结果：

METTL14在肾透明细胞癌中存在低表达的现象，且METTL14的表达水平与肾

透明细胞癌的恶性程度呈负性相关，表达水平低的患者预后相对较差。METTL14

表达水平的改变对细胞的增殖无明显影响，而敲低METTL14后细胞的侵袭转移速

度显著加快，反之，过表达METTL14后侵袭转移速度显著减慢。在动物实验中，

肾原位癌模型以及肺转移模型均表明敲低METTL14后细胞的侵袭转移能力明显增