第二章-酶分析法.pptVIP

酶及酶分析法的认识酶分析法的两种类型酶分析法的特征酶分析法的意义酶的定义：生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质。由于其表现出来的特异的催化功能，也被称为生物催化剂。酶是高效、高度专一的生物催化剂，它和生命活动密切相关。因此，酶学在生产实践基础理论研究方面，都起着非常重要的作用。酶分析法则是其中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反应的能力，对化学分析有很大的用处。酶的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制剂以及酶本身的测定。在19世纪中叶已采用酶法来测定糖类。20世纪40年代初，Warburg提出基于使辅酶还原而用光度法来测量NAD和NADP的方法。最新的发展是电化学法与荧光法的应用。酶分析法已成为一项公认的分析技术。酶分析法的两种类型酶活力测定：是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定。酶法分析：是以酶作为分析工具或分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等。原理和方法相同：都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法。不同：酶法分析中被检化合物（底物）应该是反应的限制因素，酶活力测定法中使用的底物应该过量。酶分析法的特征①选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。②灵敏度高。一般可测到10-7mol/L。如果与荧光法联用，可高达10-9mol/L左右。③反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在30分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。④酶用量甚微，所以比较经济。⑤精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。⑥适用范围有一定局限性。只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。⑦简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。酶分析法的应用酶的应用大致可分为四个方面：(1)用以制造某些产品；(2)用以去除某些物质；(3)用以识别某种化合物；(4)用以测定某种物质。(1)和(2)应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。(3)和(4)属于酶分析法的范畴。酶分析法的发展和意义一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获得各种酶制剂。由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶的固定化技术有了很快的发展，使酶的反复使用和连续使用成为可能。固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。另一方面也正在进一步简便化，或制成含酶的试纸，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等方面广泛应用。如用葡萄糖氧化酶(EC．1．1．3．4)测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标。第一节酶活力测定法一、基本概念二、酶促反应的条件三、酶活力的测定方法四、测定过程中应注意的问题一、基本概念●酶活力：酶催化一定化学反应的能力酶活力测定的实质：是测定一个被酶所催化的化学反应的速度，可以用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示。测定方法：终点法动力学法●酶的活性单位：是指在25oC下，以最适的底物浓度、缓冲离子强度及pH值诸条件下，每分钟转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。酶的比活性即定为一毫克酶的活性单位。在实际工作中,为了简便，人们往往采用各自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得的物理量表示。如以吸收度的变化值(△A/△t)表示酶单位。二、酶促反应的条件选择反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应能正常地发挥作用。也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处于最适条件。（1）底物①底物(包括人工合成底物)最好在物理化学性质上和产物不同。有些酶作用的底物和产物本身就有这种特点，如脱氢酶用的NAD(P)+和NAD(P)H；有的则