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pcr上岗证题库及答案

一、PCR技术基础知识

1.请简述PCR技术的全称及基本原理。

PCR技术全称为聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）。其基本原理是模拟体内DNA复制过程，通过温度循环控制，在体外特异性扩增目标DNA片段。反应分为三个基本步骤：（1）变性：高温（94-95℃）使双链DNA解旋为单链；（2）退火：降低温度（50-65℃），引物与单链DNA模板的互补序列特异性结合；（3）延伸：在DNA聚合酶作用下（通常为Taq酶，最适温度72℃），以dNTP为原料，从引物3’端延伸合成新的DNA链。通过25-40个循环，目标DNA片段以指数级扩增。

2.PCR反应体系通常包含哪些核心组分？各组分的主要作用是什么？

核心组分及作用：（1）DNA模板：待扩增的目标核酸，提供复制的起始序列；（2）引物：人工合成的单链寡核苷酸（18-25个碱基），决定扩增的特异性和目标区域；（3）dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，作为DNA合成的原料；（4）DNA聚合酶：催化dNTP沿模板链延伸，常用热稳定的TaqDNA聚合酶；（5）缓冲液：维持反应体系的pH值（通常7.5-8.5），提供Mg2+（激活聚合酶活性的关键离子）及其他离子（如K+）；（6）去离子水：作为反应介质，确保各组分浓度准确。

3.解释“退火温度”的定义及其对PCR结果的影响。

退火温度是引物与模板DNA互补结合的温度。其高低直接影响引物与模板的结合特异性：（1）温度过低：引物可能与非特异性位点结合，导致非目标片段扩增（假阳性）；（2）温度过高：引物无法与模板有效结合，导致目标片段扩增效率降低甚至失败（假阴性）。最佳退火温度通常比引物的解链温度（Tm值）低5℃左右，可通过梯度PCR实验优化确定。

4.实时荧光定量PCR（qPCR）与常规PCR的主要区别是什么？其定量原理是什么？

区别：（1）检测方式：常规PCR通过电泳观察终点产物，qPCR在扩增过程中实时监测荧光信号；（2）结果分析：常规PCR为定性或半定量，qPCR可准确定量初始模板浓度；（3）污染风险：qPCR闭管检测，减少扩增产物污染风险。

定量原理：基于“Ct值（循环阈值）”与初始模板量的对数呈线性关系。Ct值指荧光信号达到设定阈值时的循环数，初始模板量越多，Ct值越小。通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，可计算未知样本的模板浓度。

二、PCR实验室操作规范

5.PCR实验室分区的基本要求是什么？各区的主要功能是什么？

PCR实验室应严格分为四个独立区域（单向流程，避免交叉污染）：（1）试剂准备区：配制、分装PCR反应体系（不含模板和扩增产物）；（2）样本处理区：样本的接收、前处理（如核酸提取）及模板添加；（3）扩增区：进行PCR扩增反应；（4）产物分析区：检测扩增产物（如电泳、qPCR读数）。若使用实时荧光定量PCR，扩增区与产物分析区可合并，但需确保扩增产物不泄露至前两区。

6.核酸提取过程中，如何避免样本间的交叉污染？

关键措施包括：（1）使用带滤芯的移液器吸头，防止气溶胶污染；（2）每次处理不同样本后，用75%乙醇或10%次氯酸钠擦拭操作台面；（3）样本处理区与其他区域严格物理分隔，避免人员、物品交叉流动；（4）提取试剂分装使用，避免反复冻融；（5）设置阴性对照（无模板反应），监测污染情况；（6）核酸提取仪需定期清洁，避免残留核酸污染。

7.简述PCR加样操作的注意事项。

（1）严格分区操作：试剂准备、样本添加分别在对应区域完成；（2）移液器校准：使用前检查移液器精度（定期送检），避免体积误差；（3）防气溶胶污染：使用带滤芯吸头，加样时避免吸头触碰管壁或液面；（4）混匀方式：轻柔吹打或离心，避免剧烈震荡导致气溶胶产生；（5）标记清晰：反应管需标注样本编号，避免混淆；（6）操作时间控制：样本及反应体系避免长时间暴露于室温（尤其RNA样本需冰上操作）；（7）废弃物处理：使用过的吸头、离心管及时放入医疗废物专用袋，防止污染扩散。

8.PCR扩增程序设置错误可能导致哪些问题？如何验证程序的准确性？

错误设置可能导致：（1）变性不彻底：双链DNA未完全解旋，引物无法结合，扩增效率低；（2）退火温度/时间不当：非特异性扩增或无产物；（3）延伸时间不足：长片段扩增不完全；（4）循环数过多：导致平台期效应，定量不准确（qPCR）或非特异性条带增强（常规PCR）。

验证方法：（1）使用已知阳性样本进行预实验，观察扩增产物是否符合预期（如片段大小、Ct值）；（2）通过梯度PCR优化退火温度；（3）定期用标准品验证扩增程序的稳定性；（4）检查扩增仪温度准确性（使用温度验证仪