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医学免疫学实验指导：凝集反应

一、实验概述

（一）实验目的

1.掌握凝集反应的基本原理及分类（直接凝集反应、间接凝集反应）。

2.熟练掌握直接凝集反应（玻片法、试管法）的操作流程、结果观察及判定方法。

3.理解凝集反应在临床诊断中的应用场景，如ABO血型鉴定、细菌鉴定、抗体效价测定等。

4.培养严谨的实验操作习惯、规范的结果记录能力及实验安全意识。

（二）实验原理

凝集反应是指颗粒性抗原（如细菌、红细胞、乳胶颗粒等）与相应抗体在适当电解质存在的条件下，相互结合形成肉眼可见的凝集块的反应。其本质是抗原与抗体的特异性结合，使颗粒性抗原失去分散性，聚集形成沉淀物或凝集物。

根据实验方法和参与反应的成分不同，可分为两类：①直接凝集反应：颗粒性抗原直接与相应抗体结合产生凝集，如ABO血型鉴定、细菌的玻片凝集鉴定；②间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞）表面，再与相应抗体或抗原结合产生凝集，如类风湿因子检测、病毒抗体检测等。本实验重点开展直接凝集反应相关操作。

（三）实验对象

医学检验、临床医学、免疫学等相关专业学生

（四）实验时长

2学时（90分钟）

二、实验材料与仪器

（一）实验材料

1.抗原：人红细胞悬液（A型、B型、O型，5%浓度）、伤寒沙门菌菌液（1×10?CFU/mL）。

2.抗体：抗A血型血清、抗B血型血清、伤寒沙门菌诊断血清（多价及单价）、生理盐水（阴性对照）。

3.其他：载玻片、凹孔载玻片、试管、吸管（1mL、0.2mL）、滴管、酒精灯、接种环、无菌生理盐水、记号笔、吸水纸。

（二）实验仪器

离心机（3000r/min）、恒温培养箱（37℃）、显微镜、试管架、玻片架

三、实验内容与操作步骤

实验一：直接凝集反应（玻片法）——ABO血型鉴定

1.实验原理

ABO血型鉴定基于红细胞表面的A、B抗原与血清中相应抗A、抗B抗体的特异性直接凝集反应。根据凝集结果可判定血型：仅与抗A血清凝集为A型；仅与抗B血清凝集为B型；与抗A、抗B血清均凝集为AB型；均不凝集为O型。

2.操作步骤

（1）准备载玻片：取洁净载玻片1张，用记号笔在左侧标注“抗A”，右侧标注“抗B”，中间标注“样本编号”。

（2）加血清：用滴管分别向载玻片左侧“抗A”区域滴加抗A血型血清1滴，右侧“抗B”区域滴加抗B血型血清1滴（滴加时滴管垂直，避免血清挂壁或污染）。

（3）加抗原：用无菌吸管吸取5%待检人红细胞悬液，分别向抗A、抗B血清滴旁各滴加1滴（滴加量与血清相当，约0.05mL）。

（4）混合反应：用洁净接种环分别将血清与红细胞悬液轻轻混合均匀（注意：抗A与抗B区域的接种环需分开使用，或先混合一侧后灼烧灭菌再混合另一侧，避免交叉污染）。

（5）孵育观察：将载玻片置于室温（20-25℃）孵育5-10分钟，期间可轻轻晃动载玻片（动作轻柔，避免凝集块分散），肉眼观察凝集现象；若肉眼观察不清晰，可置于显微镜低倍镜下观察。

3.结果判定标准

阳性（+）：红细胞聚集成肉眼可见的凝集块，液体澄清，显微镜下可见大量红细胞聚集。

阴性（-）：红细胞均匀分散，无凝集块，液体呈均匀红色，显微镜下红细胞单个分散。

血型判定：抗A（+）、抗B（-）→A型；抗A（-）、抗B（+）→B型；抗A（+）、抗B（+）→AB型；抗A（-）、抗B（-）→O型。

实验二：直接凝集反应（试管法）——伤寒沙门菌抗体效价测定

1.实验原理

试管法直接凝集反应可用于测定血清中特异性抗体的效价（滴度），即血清中抗体的最高稀释度仍能与抗原发生明显凝集的稀释倍数。本实验以伤寒沙门菌菌液为抗原，与不同稀释度的待检血清反应，通过观察凝集情况确定抗体效价，为临床诊断伤寒感染提供依据。

2.操作步骤

（1）试管编号与稀释：取洁净试管7支，排列于试管架上，编号1-7。向每支试管中各加入无菌生理盐水0.5mL。用1mL吸管吸取待检血清0.5mL，加入第1号试管中，轻轻吹吸3-5次混合均匀（注意吸管尖端不触及试管壁）；从第1号试管中吸取0.5mL混合液加入第2号试管，同样混合均匀；依此类推，直至第6号试管，从第6号试管中吸取0.5mL混合液弃去（此时1-6号试管血清稀释度分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64）；第7号试管不加血清，仅含生理盐水，作为阴性对照。

（2）加抗原：向每支试管（1-7号）中各加入伤寒沙门菌菌液0.5mL，轻轻摇匀（此时各试管血清最终稀释度为1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，第7号对照管为菌液+生理盐水）。

（3）孵育：将所有试管置于37℃恒温培养箱中孵育2-4小时，或置于56℃水浴箱中孵育1小时后，取出置于室温静置过夜（确保抗原抗体充分结合）。

（4）结果观察：观察时先观察阴性对