非洲猪瘟病毒（ASFV I 型毒株、ASFV II 型毒株混合或 ASFV III 型嵌合毒株）实时 荧光定量 PCR 检测技术规程.docxVIP

ICS11.220

CCSB41

NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0403—2025

非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII

型毒株混合或ASFVIII型嵌合毒株）实时

荧光定量PCR检测技术规程

2025-11-17发布2025-12-17实施

宁夏饲料工业协会发布

I

T/NXSLX0403—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司、惠农区动物疾病预防控制中心、贺兰县农业技术推广服务中心、同心县动物疾病预防控制中心。

本文件主要起草人：马龙、李莉、艾文、葛栋、李知新、张玉玲、尹才、罗龙龙、靳善来、吴绿怡、吴昊林、陈思思、裴元礼、任子煜、路静、王晓亮、周海宁。

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非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII型毒株混合或ASFVIII型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII型毒株混合或ASFVIII型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测时的实验室检测样品采集及处理、荧光定量PCR方法、结果判定、注意事项。

本文件适用于猪全血、血清、口鼻拭子、组织、环境拭子等样本中的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18648-2020非洲猪瘟诊断技术

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ASF:非洲猪瘟（AfricanSwineFever）

ASFV:非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）

PBS:磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedBolution）

PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)

4生物安全措施

进行ASFV实时荧光定量PCR检测时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB/T19489执行。

5实验室检测样品采集及处理

5.1试剂

5.1.10.1mol/LPBS(pH7.4).配制方法见附录A的A.1。

5.1.20.4mol/LPBS(pH7.4).配制方法见A.2。

5.1.350%甘油-PBS保存液.配制方法见A.3。

5.2采样用具

5.2.1器械：剪刀、镊子、组织匀浆器等。

5.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2ml、5ml、10ml）、样品保存管等。

5.2.3个人防护用具：防护服、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。

5.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。

5.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。

5.3样品采集

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5.3.1全血样品采集

在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5ml，密封后冷藏或冷冻保存。

5.3.2血清样品采集

在每一发病猪中，采集发病猪、同群猪全血各5ml，室温放置12~24h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。

5.3.3口、鼻拭子采集

采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物；蘸取分泌物后，立即将拭子侵入1ml50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏冷冻保存。

5.3.4组织样品采集

采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏等。脾脏、肾脏采集约3cm×3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集。将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。

5.3.5环境拭子采集

采集病死猪或发病猪、同群猪圈内地面周边环境拭子样品。用医用棉签在圈内四周和中间方向蘸取