4-基因文库的建立.pptVIP

第四章??

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基因文库的建立

?;基因文库(genelibrary)

基因组文库(genomiclibrary)

cDNA文库(cDNAlibrary)

;第一节

基因组文库的构建;定义：

含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。

一.基因组文库的规模

N—基因组文库克隆总数P—所需机率

N=f—插入片段与基因组DNA长度之比

二．建立基因组文库的一般程序

1．载体DNA片段的制备

DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应

2．供体DNA片段的制备

总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段

完全酶切;3.供体与载体DNA连接

要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。

4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增

利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）

5.基因组文库质量的评价

1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。

2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。;三.??利用质粒载体

构建基因组文库;四.??利用λ载体构建基因组文库

1.载体DNA片段的制备方法:左右臂DNA片段的获得

2.供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法

3.重组DNA分子的形成：

控制克分子比率，使其形成串状DNA分子

4.重组DNA分子的包装

1）λDNA的包装物的制备

使用的大肠杆菌菌株：

E.coliBHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包装蛋白

E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-头部蛋白;;利用单COS质粒载体文库;利用双COS质粒载体

构建基因组文库;六.利用P1载体构建基因组文库

构建过程也与λ载体构建过程十分相似:

1.两臂DNA片段的制备:pAD10sacBBamHI/ScaI

2.?供体DNA片段的制备:部分酶切蔗糖梯度离???

3.?两DNA的连接和重组DAN分子的包装

1)??包装物制备用菌株:

E.coliNS3208[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1)]:制备pacase

E.coliNS3210[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131)]:制备头部蛋白

2)重组DNA分子的包装与感染

与λ重组子包装相似,然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrAΔ(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(λimm434nin5X1-cre)(λimmλLP1),每微克DNA可在Kanr平板上4X105-2X106Kanr。;利用P1载体

构建基因组文库;七.利用YAC载体构建基因组文库

1.两臂DNA片段的制备:

pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化

2.供体DNA片段的制备:

琼脂糖凝胶-DNA样品的制备EcoRI部分酶切脉冲场凝胶电泳片段回收和纯化

3.DNA的连接

4.重组DAN分子的转化:原生质体转化法

5.转化子的保存:单菌落保存于