05--菌种的传代与保藏.pptVIP

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;如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态；;二、菌种代号的意义

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三、常用菌种保藏方法

;选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。

（二）菌种保藏步骤

①挑选特征典型的单个菌落；

②确定保藏的合适菌体形态；

③选择最适宜的保藏方法；

④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。

;1.琼脂斜面低温保存法;大肠杆菌斜面藤黄微球菌斜面;黑曲霉改良马丁琼脂斜面典型斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4℃0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。

;各类菌种保藏条件及时间

;（3）特点：

优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。

缺点是——保藏期较短；传代次数多易发生变异及污染。

;（4）注意事项：

实验用的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

生孢梭菌可用庖肉培养基或硫乙醇酸盐流体培养基（前者效果更佳）。

必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。

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2、液体石蜡保存法：

本法是用液体石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。

;将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。

适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。;

液体石蜡对各类菌种保藏效果

;各类菌???保藏条件及时间

;;3.将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。

4.液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1㎝为宜。??????

5.制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

;半固体琼脂培养基（0.5%）液体石蜡保存

;3、其他保存方法简介;标准菌种保藏管;四、试验用菌种的培养传代方法

;1菌种的复苏

参考流程：

?把冻干菌种管、灭菌滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、灭菌生理盐水、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。

?先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取灭菌生理盐水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。

;?取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤置35~37℃培养22~24h。

?取出培养物，接种至营养琼脂斜面于35～37℃培养22～24h，取出后仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

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2菌种的传代与保存

;?堵上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。

?取出接种棒，在火焰旁将培养基管管塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

?将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。;斜面接种时的无菌操作

(1)接种灭菌(2)开启试管塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好试管塞;方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面