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基因工程实验;实验五引物设计及PCR扩增靶基因;PCR引物设计;（3）引物3’末端的碱基。引物3’末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是A时，容易发生错配，所以引物3’末端最好不要为A；

（4）引物的G+C含量一般为40％～60％，过高或过低都不利于引发反应；

（5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。

（6）两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）；

（7）引物的5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物3端是延伸的开始，不能进行任何修饰。;可通过两个方法将序列输入软件中;选择序列文件所在位置;在对话框中输入待扩增序列

点击左上角的“Primer”按钮;可对引物进行增加或减少碱基;;“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”

5CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3;一、概述;二、PCR基本原理;引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。

通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。;DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。

早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。

随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。

目前商品化的DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。

TaqDNA聚合酶最适工作温度为75-80℃。该酶具有5′→3′聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。;4、脱氧核糖核酸;缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。

其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链温度。;变性：是指模板的热变性，双螺旋???版DNA成为单链的DNA分子；在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是TaqDNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。

退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。;下面为一个典型的PCR循环参数设置：;三、影响PCR因素;引物决定了PCR产物的长度和特异性。

引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。;退火温度与引物的Tm值相关，一般比Tm值低5~10℃。

退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低PCR效率。

在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为30s基本上就足够了。;所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的最佳温度为70～80度，所以延伸温度设为72℃即可。

在实践中TaqDNA聚合酶的延伸效率约为500bp/30s，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。;DNA模板：以pPIC9-NGAL为模板，来扩增不包含信号肽序列的NGAL编码区

引物：

PCR上游引物（P1）：5′-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3′

PCR下游引物（P2）：5′-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3′

底下有横线的碱基为酶切位点：XholI(P1)，EcoRI(P2)

2×TaqPCRMasterMix（广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为：

0.1UTaqDNAPolymerase/ml

500mMdNTPeach

50mMTris-HCl(pH8.7)

20mMKCl

4mMMgCl2

无菌水

100bpplusladderDNAmarker;实验操作;多种??

肺炎

细菌均可引起大叶性肺炎，但绝大多数为