扬子鳄卵子发生过程中靶向Cadherin家族基因调控miRNA的预测及初步验证.pdfVIP

扬子鳄卵子发生过程中miRNA的筛选及其靶向Cadherin家族基

因调控关系的预测及初步验证

摘要

与其他脊椎动物不同，鳄类原始生殖细胞的增殖和原始卵泡的形成，在出生后

和成年阶段都会持续性发生，扬子鳄作为我国特有I级重点保护动物，追求其生殖

配子的利用最大化，始终是扬子鳄人工繁育与物种保护进程所面临的重要课题。

本研究以不同初孵日龄（dayspost-hatched;dph），暨初孵第1天（1-dph）、

15天（15-dph）、30天（30-dph）、60天（60-dph）、90天（90-dph）和300天

（300-dph）雌性扬子鳄为研究对象，利用PAS染色和性腺组织连续切片观察扬子

鳄卵子发生进程中的组织形态学特征，并统计各级卵泡数量及卵母细胞减数分裂进

程的动态变化。结果显示在1-dph扬子鳄性腺内观察到大量由紧密排列的卵母细胞

组成的卵母细胞巢；虽自15-dph起性腺组织已出现少量达到双线期阻滞阶段的卵母

细胞，300-dph仍有处于具备细线期染色质形态特征或尚未启动减数分裂的卵母细

胞存在。此外，在各dph时期均同时观察到了以聚集状态（卵母细胞巢），以单一

状态与扁平状前体颗粒细胞相邻，以及完全被立方颗粒细胞包裹的的卵母细胞。相

关结果提示鳄目物种在卵母细胞减数分裂及其与前体颗粒细胞间的互作进程等均表

现出极大异步性。

结合上述卵子发生进程的组织形态学特征和生殖细胞数量变化的动态分析，我

们进一步选择1-dph（AH），15-dph（BH）和90-dph（CH）作为卵母细胞巢、原

始卵泡和初级卵泡形成过程中的关键事件节点，将上述3个时间节点性腺组织开展

测序和miRNA文库构建。相关结果表明：在测序所得的已知miRNA中，AH、BH

和CH三个时期分别比对上315、298和302种miRNA；三个时期分别得到146、

143和148种新miRNA。miRNA表达水平两两比对结果显示，在AHvsBH中，共

有差异miRNA189种，其中下调miRNA有91种，上调miRNA有98种；在

AHvsCH中，共有差异miRNA181种，其中下调miRNA有85种，上调miRNA有

96种；Pathway显著性富集结果表明AHvsBH中，有4237个候选靶基因注释到154

个富集的通路上；在AHvsCH中，则有4329个候选靶基因注释到154个富集通路

上。其中在AHvsBH与AHvsCH中皆富集到细胞粘附信号通路（Celladhesion

molecule；CAMs）。

从该网络中寻找靶向与细胞粘附家族信号通路关键基因的miRNA，初步验证

miRNA-mRNA靶向关系以探讨扬子鳄卵子发生过程中表观遗传学机制研究，其中

miR-9610-3p及其靶基因CDH5,miR-143-5p及其靶基因CDH12和novel-812及其靶

基因CDH20皆以一对一的方式互相调节；CDH13仅受到novel-756的调控，CDH6

仅受到novel-355的调控，但这两个miRNA还分别参与了CDH15和CDH24的调

控。接着挑选细胞粘附家族的经典基因CDH1、CDH2和CDH3开展免疫组化实

验，确定3个时期中在扬子鳄性腺中的表达情况。通过原位杂交，我们发现靶向

CDH5的miR-9609-3p在3个时期的性腺中皆存在表达，其中大部分体腔上皮和生

殖上皮以及部分卵浆中表达较为强烈。本研究通过HE染色、PAS染色、免疫组

化、原位杂交等实验，miRNA表达谱与候选靶基因调控网络的构建和初步验证，为

后续原始卵泡组装调节机制的研究提供了理论依据。

关键词：扬子鳄；卵子发生；miRNA；Cadherin家族

ScreeningofmiRNAduringoogenesisandpredictionoftargetedCadherin

familygeneregulationrelationship