生物化学---蛋白质分离纯化.pptVIP

一、一般原则及基本步骤;二、蛋白质的分离纯化方法;（一）根据分子大小不同的纯化方法;1.透析和超滤;超过滤（ultrafiltration）;分子筛层析原理示意图;分子筛层析与洗脱曲线

;蛋白质Mr=49,000;（二）利用溶解度差别的

纯化方法;1.等电沉淀和PH控制;2.蛋白质的盐溶和盐析;3.有机溶剂分级分离;4.温度对蛋白质溶解度的影响;（三）根据电荷不同的纯化方法;1.电泳;电泳技术分类;2.聚丙烯酰胺凝胶电泳;PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N?-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。

化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED

光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED

?不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应

;3.毛细管电泳;4.等电聚焦（isoelectricfocusing）;5.聚焦层析（Chromatofocusing）;6.离子交换层析

（ion-changechromatography）

;离子交换层析原理示意图

;梯度混合器;常用的阳离子交换剂

;常用的阴离子交换剂

;（四）利用选择性吸附的纯化方法;1.羟磷灰石层析;2.疏水作用层析;（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法;亲和层析（affiuitychromatography）

;亲和层析原理示意图

;四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;2.蛋白质的纯度鉴定;例1一五肽用胰蛋白酶水解得到两个肽段和一个游离的氨基酸，其中一个肽段在280nm有吸收，且Pauly反应、坂口反应都呈阳性；另一肽段用溴化氰处理释放出一个可与茚三酮反应产生棕褐色产物的氨基酸，此肽的氨基酸排列顺序如何？;例3某肽经CNBr水解得到三个肽段，这三个肽的结构分别是：Asn－Trp－Gly-Met，Gly-Ala－Leu，Ala－Arg－Tyr－Asn－Met；用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个肽段，其中一个为四肽，用6mol/L盐酸水解此四肽只得到（Asp）2和Met三个氨基酸，问此肽的氨基酸排列顺序如何？;例4蛋白质分离纯化技术中哪些与它的等电点有关？试述这些技术分离提纯蛋白质的原理。;根据下列资料推出某肽的氨基酸排列顺序。

1）完全酸水解得到Phe、Pro、Glu、Lys、Ala.、Met和NH3

2）用FDNB试剂处理得到DNP－Phe

3）用澳化氰水解此肽得到一??以高丝氨酸内酯结尾的二肽和一个四肽

4）用胰蛋白酶水解可产生两个三肽

5）用羧肽酶A或羧肽酶B处理都不能得到阳性结果;本章小节