Pull Down实验技术原理及应用概述.pdfVIP

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AME

SCI分区：一区影响因子：9.809

Page2:我的PPT展示将从pulldown实验技术的原理、pulldown实验中的GST融合蛋白、

pulldown实验技术的方法及其具体的一些注意事项上讲述，最后再结合我所看的来具

体讲述靶标的发现和确证的过程和方法。

Page3:我把pulldown的实验原理按照自己的理解做成了示意图。椭圆形代表的是磁珠，后

面连着正方形是谷胱甘肽树脂，谷胱甘肽树脂包被着磁珠。后面的那个不规则形状I代表的

是GST融合蛋白。GST融合蛋白就是将谷胱氨肽巯基转移酶与目的蛋白通过表达融合在一起，

成为一个整体，谷胱氨肽巯基转移酶能够与包被着磁珠的谷胱甘肽特异的结合而结合在磁珠上。

然后将需要筛选的蛋白质与上述物质一起培育，充分反应，最终能与目的蛋白I发生作用的

蛋白质就能特异性结合在I上，而I结合在磁珠上，最后通过离心、洗脱就能分析能与目的

蛋白发生作用的蛋白Y以及分析结合力的强弱等等。

Page4:基于上述的原理，我们就可以看到pulldown的应用。如果I是GST融合蛋白，我们

就可以证实蛋白与蛋白的相互作用。当然，如果I是小分子，也就是说小分子能够通过一些

方式与磁珠上的树脂相连，那么pulldown就能用于证实小分子与靶标的相互作用，也就是

可以用于小分子靶标的发现和确证。

Page5：我觉得pulldown实验技术里面最难理解的词就是GST融合蛋白，然后我看了一些资

料，GST融合蛋白一般是在原核细胞表达体系中表达然后再经过纯化，主要就是用谷胱甘肽

琼脂糖球珠亲和层析来纯化GST融合蛋白。具体怎么表达的感觉挺复杂的，我具体也没看

懂，最终的结果就是将GST与我们的目的蛋白变成了一个整体。然后我们用GST做有

什么优势呢？GST是在解毒过程中起到重要作用的转移酶，天然大小为26kD。GST是一

个高溶的蛋白，能够有效地增加外源性蛋白的可溶性。同时能够在大肠杆菌中大量表达，起

到促进目的蛋白表达量提高的作用。相对于6*组氨酸来说，表达分子量小的目标蛋白来说

选择GST更有优势（融合蛋白分子量较大的比较不容易降解）。天然蛋白中可能连续存在5

个连续的组氨酸，因而可能被纯化填料吸附而混入，GST纯化填料专一性较高。

Page6：下面是pulldown实验的过程。其实在原理那边已经了。就是将包被有谷胱甘肽

琼脂的磁珠、GST融合蛋白、以及细胞裂解也充分反应。最终能与目的蛋白一起固定到磁珠

上的就可能是能与目标蛋白发生作用的靶蛋白。但从图上我们可以看到他设置了对照实验，

后面我会说到为什么要做对照实验以及意义。

Page7:在所有沉降实验中对照的设立是必须的。在对照实验中只加入亲和基质和靶标

混合液，而不加诱饵蛋白，从而能够帮助排除和亲和基质发生特异性结合的假阳性。而另一

组对照实验中，只有亲和基质、诱饵蛋白和无靶蛋白的蛋白混合液，从而能够排除和诱

饵蛋白中的蛋白非特异性结合的假阳性，这一组对照实验组也能作为阳性对照，说明亲

和基质能够有效地捕捉带的融合诱饵蛋白。

Page8:SDS的上样缓冲液和蛋白的竞争物都难能够作为洗脱工作液。SDS的

上样缓冲液作为洗脱工作液往往具有更强的洗脱能力，但是往往会导致蛋白变性，上样缓冲

液可以从基质上洗脱下与亲和基质发生强相互作用的非特异性结合的蛋白质以及导致基质

脱落。竞争性洗脱工作液能特异性洗脱蛋白质，是一种非变性的洗脱方法，能够保证蛋白质

的自然状态，有利于后续分析。另外一种洗脱液能够选择性的将靶蛋白洗脱，而保持诱饵蛋

白仍然与基质相连。同时还能够蛋白质相互作用强弱的信息。

Page9:下面就是我这次找的文献，里面它也有一小部分用Pulldown来用于靶标的发现。在

肺杆菌出现耐药性的背景下通过高通量筛选发现的了一个小分子具有很强的活性，也就

是TCA1.然后发现和确证它的靶标，一个是DPr1，这个蛋白对肺杆菌的细胞壁合成很重

要。另一个是MoeW，参与钼辅因子的合成，对肺杆菌无氧状态的至关重要。

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