大肠杆菌中鼠类逆转录病毒逆转录酶纯化与特性研究.pdfVIP

在大肠杆菌中表达的鼠类逆转录逆转

录酶的纯化与表征*

(收到)

莫妮卡・J・‡，奈子・斯蒂芬・P・

来自哥伦比亚大学医学院生物化学系和，纽约，纽约10032

在大肠杆菌中表达莫洛尼鼠白血病（M‑MuLV）pol的一个区域，导致产

生了可在粗提物中检测到的逆转录酶活性。构建该3′末端的突变体，导致粗裂解液可

溶部分的逆转录酶活性水平提高了4倍，并且产生了一种稳定的蛋白物种，分子量为=71,000。通过DEAE‑纤维素、磷酸

r

纤维素、多聚核糖胞苷酸-琼脂糖和羟基磷灰石柱层析纯化这种蛋白，表明它是一种多功能

酶，含有RNaseH和逆转录酶活性。=71,000的物种通过甘油梯度离心测定其

沉降系数为4.65S，表明该酶为单体。使用寡聚(dT)引物的poly(A)+mRNA，该

酶合成了长度在

22

1.3至9.9千碱基之间的双链拷贝。长c的合成需要8mMMg+、4mMMn+、

2mMdNTPs和饱和水平的酶。放线菌素D能有效限制酶进行第一次链合成。文中

还描述了融合蛋白的其他特性。

在逆转录生命周期的早期阶段，RNA被形成双链，该整合到

宿主中以生成前（综述见参考文献1）。的pol编码许多参与这些

步骤的酶活性。pol产物最初表达为多蛋白Pr200gag−pol(2)，经过蛋白水解处

理后产生几种成熟蛋白质(3)。遗传和生化数据支持将蛋白酶功能定位于pol的

末端(4)，RNaseH和逆转录酶活性定位于大区域(5)，以及建立整合前所需的功能定位于末端(5,6)。

5′3′

1逆转录酶已被纯化(7,8)，并证明是一种分子量在70,000到

80,000道尔顿之间的单体(7,8)。纯化的蛋白质

已证明该酶具有酶活性（RNaseH），可以降解RNA‑杂交体中的RNA（7,8）。由于从

逆转录颗粒中分离出的酶量较少，对其特性的详细分析受到了限制。

PurificationandCharacterizationofMurine

RetroviralReverseTranscriptaseExpressedin

Escherichiacoli*

(Receivedforpublication,January24,1985)

MonicaJ.Roth‡,NaokoTanese,andStephenP.Goff

FromtheDepartmentofBiochemistryandInstituteforCancerResearch,Columbia

University,CollegeofPhysiciansandSurgeons,NewYork,NewYork10032

ExpressionofaregionoftheMoloneymurineleukemiavirus(M-MuLV)polgenein

Escherichiacoliresultedinthesynthesisofreversetranscriptaseactivitywhichcouldbe