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水质检测中总大肠菌群的实验方法详解

总大肠菌群作为水质卫生状况的关键微生物学指标，其检测结果直接反映了水体受粪便污染的可能性，对于保障饮用水安全及评估水体环境质量具有不可替代的意义。准确、规范地进行总大肠菌群检测，是每一位水质分析工作者必备的专业技能。本文将从实验原理、主要试剂与仪器、操作步骤、结果判读及质量控制等方面，对总大肠菌群的检测方法进行系统阐述，旨在为相关实践提供具有指导性的参考。

一、检测原理概述

总大肠菌群的检测基于其生物学特性，主要利用该类菌群在特定培养条件下的生长与代谢特征进行定性和定量计数。通常采用的是多管发酵法或滤膜法。多管发酵法的原理是将水样接种于含乳糖的液体培养基中，在适宜温度下培养，观察是否产酸产气（初步发酵试验），以推测总大肠菌群的存在。对产酸产气的阳性管，需进一步进行分离培养和证实试验，以确定其是否为总大肠菌群。滤膜法则是利用孔径适宜的滤膜截留水中的微生物，随后将滤膜置于选择性培养基上培养，通过观察特征菌落的生长情况进行计数。两种方法各有其适用范围和操作特点，实验者需根据水样类型、污染程度及检测目的进行选择。

二、主要仪器与试剂准备

（一）核心仪器设备

实验过程中，一些基础而关键的仪器是确保实验顺利进行的前提。恒温培养箱是不可或缺的，用于提供菌群生长所需的稳定温度环境，其控温精度应能满足实验要求。高压蒸汽灭菌器则用于培养基、稀释水及其他实验器皿的灭菌处理，保障无菌操作的基础。此外，还需配备超净工作台或生物安全柜，为接种等无菌操作提供局部洁净环境。培养皿、试管（包括发酵管，需配备倒置小导管）、移液枪（及配套吸头）、酒精灯、试管架、灭菌镊子、菌落计数器等也是日常操作的必需工具。对于滤膜法，还需添置滤膜孔径为0.45μm的滤膜、滤膜过滤器、抽滤装置等。

（二）关键培养基与试剂

培养基的质量直接关系到检测结果的准确性。乳糖蛋白胨培养液是多管发酵法中用于初步发酵和复发酵试验的核心培养基，它能为总大肠菌群的生长提供碳源和氮源，并通过乳糖发酵产酸产气现象指示目标菌群的存在。伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）则常用于平板分离，总大肠菌群在此培养基上会形成具有特征形态的菌落，便于观察和鉴别。此外，磷酸盐缓冲液或生理盐水作为稀释水，用于水样的梯度稀释。所有培养基在使用前均需按照规定程序进行灭菌，确保无菌且性能稳定。

三、实验操作步骤详解

（一）样品采集与保存

水样的采集是检测工作的第一步，其规范性直接影响后续结果的可靠性。采样前，需对采样容器（通常为灭菌广口瓶）进行严格检查，确保无破损、无污染。采集过程应遵循无菌操作原则，避免引入外界杂菌。对于自来水等管道水，应先放水数分钟，以去除管道内积存的死水。采集水样时，应使水样缓缓流入容器，避免搅动底部沉积物，且不留过多顶部空间。水样采集完毕后，应立即贴上标签，注明样品名称、采集地点、时间、采样人等信息。

总大肠菌群检测对时效性要求较高，水样采集后应尽快进行分析。若无法立即检测，需在0～4℃条件下冷藏保存，但保存时间不宜过长，一般不应超过规定时限，且在运输过程中需确保温度稳定，避免冻融或温度过高导致菌群数量变化。

（二）样品稀释（视水样污染程度而定）

对于污染程度较高的水样，直接接种可能导致菌落过度生长而无法计数，因此需要进行适当稀释。稀释操作同样需在无菌条件下进行。根据对水样污染情况的预估，选择适宜的稀释倍数。通常采用十倍系列稀释法，即取一定体积水样加入到灭菌稀释水中，充分混匀后再进行下一级稀释。每一步稀释都应更换新的移液枪头或移液管，确保稀释倍数的准确性。稀释倍数的选择应以最终能获得适宜菌落数（或阳性管数）的培养结果为目标。

（三）接种与培养

1.多管发酵法

初步发酵试验：根据水样的清洁程度或稀释倍数，选择不同体积的水样分别接种到若干支乳糖蛋白胨发酵管中。例如，对于较清洁的水样，可直接接种较大体积；对于稀释水样，则从不同稀释度各取适量接种。接种完成后，将发酵管置于36±1℃的恒温培养箱中培养24±2小时。培养期间应避免频繁开启培养箱，以维持温度稳定。

平板分离与复发酵试验：培养24小时后，观察发酵管是否产酸产气。产酸表现为培养基由紫色变为黄色，产气则可见倒置小导管内有气泡积聚。对于产酸产气的阳性管，需用接种环取其培养物，在伊红美蓝琼脂平板上进行划线分离，以获得单个菌落。划线完毕的平板同样置于36±1℃培养箱中培养18～24小时。之后，观察平板上菌落形态，挑取可疑的总大肠菌群菌落（典型菌落通常呈紫黑色、有金属光泽，或淡紫红色、中心较深等），再次接种到乳糖蛋白胨发酵管中，进行复发酵试验，培养条件同初步发酵。若复发酵管仍产酸产气，则可证实为总大肠菌群阳性。

2.滤膜法

选取适宜孔径的滤膜，用无菌操作将其安装在滤膜过滤器上。根据水样污染程度，吸取一定体积水样通过滤膜过滤，使水中的微