CN112908417B 功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、nadh偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用 （浙江工业大学）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN112908417B(45)授权公告日2025.01.10

(21)申请号202011613020.8

(22)申请日2020.12.30

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN112908417A

(43)申请公布日2021.06.04

(73)专利权人浙江工业大学

地址310014浙江省杭州市下城区潮王路

18号

(72)发明人薛亚平程峰张嘉敏邹树平

徐建妙郑裕国

(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224

专利代理师沈金龙

(51)Int.CI.

G16B20/50(2019.01)

G16B35/00(2019.01)

G16B50/30(2019.01)

(56)对比文件

CN102652175A,2012.08.29审查员顾明海

权利要求书1页说明书9页序列表9页附图3页

(54)发明名称

功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用

LeGDH-A1440LeGDH-A1440-V345A-M91ALeGDH-A1440-V375F-M9LA(57)摘要

LeGDH-A1440

LeGDH-A1440-V345A-M91A

LeGDH-A1440-V375F-M9LA

CN112908417BD=0OHOHHOHONH?+。PPOLPPT葡萄糖葡萄糖酸十本发明公开了一种功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用。所述基因挖掘方法包括：(1)分析NADH型谷氨酸脱氢酶应具备的特性序列；(2)根据特征序列搜索基因库；(3)对搜索获得的基因进行聚类分析和蛋白结构模拟；(4)选择基因聚合度高且蛋白结构与已知草铵膦脱氢酶结构类似的基因作为候选基因。经基因挖掘得到来源于堆肥赖氨酸杆菌(Lysinibacilluscomposti)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的野生型草铵膦脱氢酶，并经过突变筛选到NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体，突变位点选自以下一种：(1)A144G-

CN112908417B

D=0

OH

OH

HO

HO

NH?+

。

PPO

LPPT

葡萄糖

葡萄糖酸

十

该突变体酶能够利用廉价的辅酶NAD进行催化反

应。

CN112908417B权利要求书1/1页

2

1.一种NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，由来源于堆肥赖氨酸杆菌 (Lysinibacilluscomposti)的野生型草铵膦脱氢酶突变所得，野生型草铵膦脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体的突变位点选自以下一种：

(1)A144G-V375F-M91A;

(2)A144G-V345A-M91A;

(3)A144G。

2.编码如权利要求1所述NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体的基因。

3.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包含如权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的基因工程，其特征在于，目的基因还包括葡萄糖脱氢酶的编码基

因。

5.如权利要求4所述的基因工程，其特征在于，葡萄糖脱氢酶的编码基因序列对应的GenBank登录号为KM817194.1。

6.权利要求1所述NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体、权利要求2所述基因或权利要求3~5任一所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

7.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物，在无机氨基供体、辅酶再生循环系统及对应辅助底物存在的条件下，利用催化剂催化底物反应获得L-草铵膦；

所述催化剂为以下一种：

(1)权利要求1所述NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体；

(2)能够表达权利要求1所述NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体的基因工程菌或该基因工程菌经裂解得到的粗酶液。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述辅酶再生循环系统使用葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶或醇脱氢酶偏好型的辅酶再生循环系统。

9.功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分析NADH型谷氨酸脱氢酶应具备的特性序列，特征序列包括：

(1.1)蛋白质大小：候选蛋白质的长度为300-500个氨基酸，

(1.2)草铵膦脱氢酶的两段