基因工程复习资料汇总及重点.docxVIP

基因工程复习资料汇总及重点

一、绪论：基因工程的基石与蓝图

1.1基因工程的核心定义与内涵

基因工程，亦称重组DNA技术或遗传工程，其核心在于依据预先设计的蓝图，在体外对不同来源的遗传物质（主要是DNA分子）进行“剪切”、“拼接”与“重组”，进而将重组后的DNA分子导入特定的宿主细胞，使其能够在宿主细胞内进行复制、转录和翻译，最终实现基因的定向改造与表达，产生人类所需的基因产物或赋予生物体新的遗传特性。这一技术的本质是对遗传信息的人工操纵与重新编程。

1.2基因工程的理论支柱

基因工程的诞生并非偶然，它建立在坚实的理论基础之上：

*DNA是遗传物质的证明：肺炎双球菌转化实验等经典研究确立了核酸作为遗传信息载体的核心地位。

*DNA双螺旋结构模型：Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构，揭示了遗传信息的存储方式和复制机制，为DNA的体外操作提供了理论依据。

*中心法则与遗传密码的破译：阐明了遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递规律，以及核苷酸序列与氨基酸序列之间的对应关系，为基因表达产物的预测和设计奠定了基础。

1.3基因工程的技术先驱

关键技术的突破是基因工程得以实现的前提：

*限制性核酸内切酶的发现与应用：被誉为“分子手术刀”，能够特异性识别和切割DNA序列，是DNA片段化和重组的关键工具。

*DNA连接酶的发现与应用：作为“分子缝合针”，能够催化DNA片段之间形成磷酸二酯键，实现不同DNA分子的体外连接。

*基因载体的构建：如质粒、噬菌体等，为外源基因的导入和在宿主细胞内的复制提供了“分子运输车”。

*感受态细胞的制备与转化技术：解决了外源DNA进入宿主细胞的难题。

*核酸序列分析技术：为基因的精确操作和鉴定提供了可能。

1.4基因工程的发展历程与里程碑事件

从20世纪70年代初首例基因工程实验成功（Cohen和Boyer），到基因测序技术的飞速发展，再到基因编辑技术的革命性突破，基因工程的每一步进展都深刻影响着生命科学研究和人类社会。理解其发展脉络有助于把握学科动态和技术演进逻辑。

二、基因工程的核心工具酶：分子操作的“手术刀”与“缝合线”

2.1限制性核酸内切酶（RestrictionEndonucleases,RE）

*定义与来源：主要从原核生物中分离得到，能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在特定位置切割磷酸二酯键。

*命名规则：通常根据其来源菌株的属名、种名、菌株名和发现顺序进行命名，例如EcoRI。

*分类与特性：重点掌握II型限制性内切酶的特性：识别序列通常为4-8个碱基对的回文结构，切割位点位于识别序列内部或近旁，产生粘性末端（5突出或3突出）或平末端。

*星活性（StarActivity）：在非最适反应条件下，某些限制性内切酶可能会改变其严格的识别特异性，切割与特异识别序列相似的其他序列，这一现象在实验中需特别注意避免。

*应用：DNA重组、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、基因定位与作图、DNA分子鉴定等。

2.2DNA连接酶（DNALigase）

*作用机制：催化双链DNA分子中相邻核苷酸的3-羟基和5-磷酸基团之间形成磷酸二酯键，从而将两段DNA连接起来。

*类型与特点：常用的有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。T4DNA连接酶不仅能连接粘性末端，也能连接平末端（效率较低，常需辅助因子或特殊处理），且需要ATP作为辅助因子。

*连接反应条件：温度、ATP浓度、Mg2?浓度及pH值对连接效率均有影响。

2.3DNA聚合酶

*E.coliDNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）：Klenow片段具有5→3聚合酶活性和3→5核酸外切酶活性，缺乏5→3核酸外切酶活性。主要用于填补DNA粘性末端、cDNA第二链合成、DNA序列测定等。

*TaqDNA聚合酶：来自嗜热菌，具有热稳定性，是PCR技术的核心酶。其缺乏3→5校正活性，errorrate相对较高。

*反转录酶（ReverseTranscriptase）：能以RNA为模板合成互补DNA（cDNA），是获取真核生物目的基因的重要工具，也用于RT-PCR等技术。

2.4其他重要工具酶

*核酸酶：如S1核酸酶（特异性降解单链DNA或RNA）、外切核酸酶III（从3端降解双链DNA）等，用于修饰或降解特定核酸序列。

*磷酸酶：如碱性磷酸酶（CIP或BAP），能去除DNA或RNA末端的磷酸基团，防止载体自连，提高重组效率。

*激酶：如T4多核苷酸激酶，能将磷酸基团加到DNA或RNA的5羟基末端，用于探针标记等。

三、基因克隆的载体系统：基因的“运输车”