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皮肤变态反应局部淋巴结试验方法：BrdU-FCM

SkinSensitization:LocalLymphNodeAssay:BrdU-FlowCytometryMethod（LLNA:BrdU-FCM）

1范围

本方法规定了小鼠局部淋巴结试验（LLNA:BrdU-FCM）的基本原则和试验要求。

本方法适用于化妆品用化学原料皮肤变态反应的检测。

2试验目的

检测和评价重复接触化妆品用化学原料对哺乳动物皮肤局部是否可引起变态反应及其程度，预测其潜在致敏性。

3定义

3.1皮肤变态反应（过敏性接触性皮炎）skinsensitization，allergiccontactdermatitis

皮肤对一种物质产生的免疫性皮肤反应。在人类中这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征；动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。

3.2皮肤刺激性dermalirritation

皮肤涂抹受试物后局部产生的原发可逆性炎性变化。

3.3刺激指数stimulationindex，SI

受试物组与溶剂对照组淋巴细胞增殖的比值，是评价受试物皮肤致敏能力的值。

4试验原理

过敏原引起暴露部位引流淋巴结内淋巴细胞增殖，其增殖程度与过敏原的剂量和致敏效力成比例。5-溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可代替胸腺嘧啶掺入增殖细胞新合成的DNA链中，其含量反映引流淋巴结内细胞增殖程度。用流式细胞法（FlowCytometryMethod，FCM）测定淋巴细胞中BrdU阳性细胞数，通过计算受试物组与溶剂对照组BrdU阳性细胞数的比值即刺激指数评价受试物的皮肤致敏性。

5试验的基本原则

5.1实验动物和饲养环境

选用SPF级BALB/c或CBA/J小鼠，8～12周龄，雌性，未孕或未曾产仔的。体重差异应不超过平均体重的20%。其他品系或雄性小鼠如经验证LLNA:BrdU-FCM反应不存在明显品系或性别间差异亦可使用。实验动物及实验动物设施、饲料、饮水应符合国家相应规定，试验期间自由饮水。

5.2动物试验前准备

试验前小鼠应在实验动物设施环境中至少适应5d。将小鼠随机分组标记（不要做任何形式的耳朵标记），检查皮肤应无损伤。试验开始和结束时应记录小鼠体重。

5.3可靠性检查

每次试验均需设置阳性对照组，阳性对照物通常为弱至中度致敏物，一般采用25%己基肉桂醛（CAS：101-86-0）或25%丁香酚（CAS：97-53-0），溶剂为丙酮：橄榄油（4:1，v/v）。当阳性对照物与受试物的溶剂不同时，需单独设置阳性对照物的溶剂对照组。

5.4观察指标

试验期间每天观察小鼠临床症状及耳朵局部刺激症状，并记录。

6仪器

流式细胞仪，配备前向散射光（ForwardScatter，FSC）、侧向散射光（SideScatter，SSC）通道和适宜的荧光通道，可检测异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate，FITC）-BrdU和7-氨基放线菌素D（7-AminoactinomycinD，7-AAD）标记的细胞。

7试验方法

7.1分组

小鼠随机分为阴性（溶剂）对照组、阳性对照组和受试物组（至少3个浓度），每组至少4只小鼠。另取2只小鼠，分别为空白对照小鼠和未处理对照小鼠：空白对照小鼠不做任何处理，样本用于流式细胞仪检测时参数设定；未处理对照小鼠腹腔注射BrdU标记液，样本用于流式细胞仪检测时背景值的控制。

7.2受试物配制

固体受试物应溶于或悬浮于适当溶剂中并稀释，液体受试物可以直接使用或稀释后使用。受试物应现用现配。

7.3溶剂的选择

常用溶剂为丙酮：橄榄油（4:1，v/v）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲乙酮（MEK）、丙烯乙二醇（PG）、二甲基亚砜（DMSO）等。

7.4剂量设计

通常从适当的系列浓度（如100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%等）中选择三个连续剂量。选择浓度时应考虑已有毒理学信息（例如急性毒性和皮肤刺激）以及受试物的结构和理化信息（如可用），使最高浓度达到最大化暴露，同时避免全身毒性和/或明显皮肤刺激性。

在缺少最高剂量设计依据时，应进行预试验（每组1～2只小鼠）为受试物剂量选择提供试验依据。液体受试物最高剂量可以采用原液，固体或悬浮液可采用最大可使用浓度。

7.5试验步骤

7.5.1第1d

小鼠随机分组并标记、称重、记录临床症状。将受试物或对照均匀涂抹到小鼠双侧耳朵背部皮肤，25μL/耳。空白对照和未处理对照的小鼠不涂抹。

7.5.2第2d、第3d

重复受试物或对照物涂抹，操作同第1