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血球计数板及其使用方法

在生命科学研究的日常工作中，细胞数量的精确测定是一项基础且至关重要的操作。无论是细胞培养的状态监测、微生物发酵液中菌体浓度的分析，还是临床检验中血液细胞的计数，都离不开可靠的计数方法。血球计数板，作为一种经典的细胞计数工具，凭借其操作简便、成本较低且能直接观察细胞形态的特点，至今仍在实验室中广泛应用。本文将详细介绍血球计数板的结构原理、使用方法及注意事项，以期为相关实验操作提供有益的参考。

血球计数板的结构与原理

血球计数板通常由一块特制的厚玻璃片构成，其核心部分是位于中央的两个计数室。每个计数室经过精密加工，刻有特定规格的网格线。常见的计数板类型为改良Neubauer计数板，其计数室被划分为9个大方格，每个大方格的面积为1平方毫米。在这9个大方格中，中央的一个大方格又被细分为25个中格，每个中格进一步划分为16个小格，因此中央大方格总计有400个小格。或者，有些计数板的中央大方格是由16个中格组成，每个中格再分为25个小格，同样是400个小格。这些小格的尺寸和数量是标准化的，确保了计数的统一性和准确性。

计数室的深度，即盖玻片与计数板表面之间的距离，通常为0.1毫米。因此，每个大方格的体积为1平方毫米乘以0.1毫米，等于0.1立方毫米。这一固定体积是后续计算细胞浓度的基础。当细胞悬液被准确滴加至计数室与盖玻片之间的空隙时，细胞会随机分布于各个小格中，通过显微镜观察并计数一定数量小格内的细胞数，再根据稀释倍数和计数室体积，即可推算出原始样本中的细胞浓度。

血球计数板的使用方法

准备工作不可或缺

实验开始前，需确保血球计数板和专用盖玻片的清洁。任何污渍或残留的油迹都可能干扰观察和计数，甚至导致细胞吸附，影响结果准确性。可用专用的擦镜纸蘸取少量酒精轻轻擦拭，待完全干燥后使用。同时，显微镜也需进行常规检查和清洁，确保镜头清晰，调焦顺畅。

样本的制备与稀释是关键

根据所计数细胞的类型和预期浓度，对样本进行适当的稀释是必要的。若细胞浓度过高，会导致细胞重叠难以分辨；浓度过低则会使计数误差增大。稀释液的选择需根据细胞特性而定，例如血细胞计数常用生理盐水，而酵母或细菌计数可能使用无菌水或特定缓冲液。稀释过程中，应使用移液准确的微量移液器，并确保稀释倍数的计算准确无误。一般建议通过预实验确定合适的稀释倍数，使每个计数室中大方格内的细胞数量在数十至数百个之间，以兼顾计数效率和准确性。

加样的技巧直接影响计数准确性

将清洁的盖玻片紧密覆盖在血球计数板的计数室上，注意盖玻片的放置方法，应先将一侧边缘与计数室边缘接触，然后缓缓放下，避免产生气泡。随后，用微量移液器吸取适量稀释后的细胞悬液，小心滴加在盖玻片边缘与计数板交界处的凹槽内，利用毛细作用使悬液自然充满计数室。加样量要适中，过多会导致悬液溢出，污染计数板；过少则可能使计数室未能完全充满。加样后，需静置片刻，让细胞充分沉降至计数室底部，通常为数分钟，具体时间可根据细胞大小和悬液粘度调整。

显微镜下的观察与计数

将加样后的血球计数板放置于显微镜载物台上，先用低倍物镜（如10倍）找到计数室的网格结构，然后转换至高倍物镜（如40倍）进行细致观察和计数。计数时，通常选择计数室中具有代表性的若干个大方格进行计数，例如对于细胞分布较为均匀的样本，可计数中央大方格内的四个角和正中央的共五个中方格，或直接计数整个中央大方格。

计数过程中，需遵循一定的规则以减少误差。对于压线的细胞，通常采用“数上不数下，数左不数右”的原则，即只计数位于方格上边线和左边线上的细胞，以避免重复计数或漏计。同时，应注意区分完整的细胞与细胞碎片或杂质，对于明显的杂质或异常形态的细胞应予以排除。建议对同一份样本进行至少两次平行计数，若两次结果差异较大，应重新制备样本进行计数。

数据的处理与结果计算

完成计数后，根据以下公式计算细胞浓度：

细胞浓度(个/毫升)=(N×D×10^4)/V

其中：

*N为所计数的总细胞数；

*D为样本的稀释倍数；

*V为所计数的计数室体积（以立方毫米为单位），对于计数一个中央大方格（体积为0.1立方毫米），则V=0.1；

*10^4是将立方毫米转换为毫升的换算系数（1毫升=1000立方毫米，0.1立方毫米×10^4=1000立方毫米=1毫升）。

例如，若计数了中央大方格内的总细胞数为N，稀释倍数为D，则细胞浓度为N×D×10。此计算过程需仔细核对，避免因公式应用错误导致结果偏差。

影响计数准确性的因素与注意事项

尽管血球计数板操作看似简单，但实际应用中仍有诸多因素可能影响结果的准确性。操作者的主观判断差异、样本稀释的均匀性、加样量的精确性、细胞沉降时间不足、显微镜焦距调节不当导致的细胞模糊、以及计数室中细胞分布